MT1-MMP对血管内皮细胞分化增殖的作用研究

血管生成异常是肿瘤和缺血性疾病等发生发展的重要机制。在血管生长过程中，基质金属蛋白酶等对基底膜糖蛋白和细胞外基质成分的降解，可启动内皮细胞的增殖与分化、粘附与迁移等多个环节。膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）是其中重要的降解酶。近年来研究发现：无论在发育过程还是病理过程中， MT1-MMP的缺失都会引起血管形成障碍。但其作用环节与机制尚不清楚，特别是对血管生成的启动环节：内皮细胞的增殖分化及形成微管腔的作用机制不甚明了。本研究拟通过细胞重编程技术，构建MT1-MMP基因缺失的诱导性多能干（iPS）细胞，在该细胞向血管内皮细胞分化，以及分化的内皮细胞形成微管腔的过程中，通过与对照组和MT1-MMP基因过表达组相比较，阐述MT1-MMP在内皮细胞分化增殖及微管腔形成过程中的作用及机制。为临床上针对MT1-MMP作为靶点，防治血管损伤性疾病以及血管增生异常等疾病提供新的治疗策略。

细胞各种功能的实现依赖于细胞外微环境提供的各种条件和刺激信号。细胞外基质(extracellular cell matrix，ECM)是细胞外微环境的主要成分，包括一些生长因子和酶类。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是细胞外一大类基质降解酶。膜型基质金属蛋白酶l(Membrane-type 1 matrix metalloproteinase，MTl-MMP)是一种膜锚定型基质金属蛋白酶，活化后的MTl-MMP能够降解细胞外基质成分，包括I、II和Ⅲ型胶原、纤连蛋白、纤维蛋白等，并且还参与血管形成，介导基质金属蛋白酶2(metalloproteinase 2)的活化等作用。本研究将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种外源性表达的转录因子转染至成纤维细胞中，使其重编程为具有胚胎干细胞特征的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells），观察iPS细胞的形态,碱性磷酸酶染色法鉴定iPS，免疫荧光检测iPS细胞的胚胎干细胞特异性标志SSEA-1及Oct3/4的表达，并鉴定其分化潜能，以及增殖、凋亡、黏附、迁移能力。获得的iPS细胞向内皮细胞诱导分化，观察在半固体Matrix上形成微管腔结构的能力。我们的结果显示转染了Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子的C57BL/6J和MT1-MMP基因敲除的成纤维细胞，约两周后形成细胞克隆，挑取克隆，传代培养后可见胚胎干细胞样细胞克隆形式。碱性磷酸酶试剂盒对传代后两种iPS细胞进行染色，稳定转染后的细胞呈蓝紫色，明显表达ES细胞的特异性抗体SSEA-1和Oct3/4。MT1-MMP基因敲除组的细胞增殖水平、黏附能力和迁移能力明显高于C57BL/6J小鼠iPS细胞组的细胞，凋亡少于C57BL/6J小鼠iPS细胞。微管腔形成实验可见MT1-MMP基因敲除小鼠iPS细胞的微管腔形成数量多，且管腔结构较好，而C57BL/6J小鼠iPS细胞的微管腔形成数量少，管腔结构形成差。综上所述，MT1-MMP基因缺失导致小鼠iPS细胞的增殖能力、细胞粘附能力，及延展性明显增强，细胞凋亡明显降低，分化的内皮细胞微管腔形成能力增强。