抗肿瘤聚酮真菌环氧二烯生物合成基因簇克隆及产量调控分子机制解析

聚酮类(polyketides)化合物结构多样，是天然药物最主要来源。其生物合成机理有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等类型。真菌聚酮类是由重复Ⅰ型(Iterative type I)聚酮合成酶催化低级羧酸连续缩合而成。我们从红树内生真菌拟茎点霉(Phomopsis sp.) A123菌株中分离的聚酮化合物真菌去乙酰环氧二烯(deacetylmycoepoxydiene，DAM)结构新颖，以含有氧桥的8元环二烯为骨架，并发现其有较强的抗肿瘤和AMPK激活活性。项目组前期通过基因组改组技术选育得到了DAM的高产菌株(比野生型提高200多倍)，并应用于中试生产。本申请项目研究将通过比较DAM高产菌株和野生型的转录组的差异，一方面获得DAM生物合成特异的探针，克隆DAM的生物合成基因簇；另一方面结合功能基因组和生物信息学等手段，解析DAM产量调控的分子机制。为真菌聚酮组合生物学研究、产量调控和工艺优化提供指导。

真菌聚酮去乙酰环氧二烯(deacetylmycoepoxydiene，DAM)和真菌环氧二烯（mycoepoxydiene，MED）是两个结构新颖，含有氧桥的8元环二烯为骨架化合物，已发现其有较强的抗肿瘤和AMPK激活活性，为前期从红树植物内生真菌拟茎点霉(Phomopsis sp.)中分离获得。.本项目研究建立了微生物育种结合转录差异显示次级代谢产物生物合成基因簇克隆的新策略，在育种获得DAM产量提高约300倍的高产菌株基础上，建立DAM高、低产菌株的高质量SSH差减文库，获得一个与DAM生物合成相关PKS基因差异序列（113），并以之为特异性杂交探针，与构建的基因组文库杂交，克隆DAM生物合成基因簇。通过生物信息学分析基因簇中的各阅读框功能，确定基因簇中包含两个PKS序列（PKS1和PKS2），分别构建这两个PKS的RNA干扰菌株，共获得6个突变株，DAM产量均大幅下降，表明基因簇中的两个PKS均参与DAM生物合成。综合基因簇信息和从DAM高产菌株中分离得到的21个真菌环氧二烯类化合物结构，DAM生物合成基本过程为：PKS1和PKS2共同进行7个循环反应，首先合成一条含14个碳原子的主C链，经异构化、Robinson环化形成八元环、酯交换反应形成六元环，经酯化、脱水、加氧、还原和酰基转移修饰等后生成真菌环氧二烯类化合物DAM或MED。并证实了veA基因和179序列在DAM合成中分别承担正控和负控功能。.在异源表达DAM生物合成基因簇研究中，获得的表达菌株意外地激活了宿主轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）罕见地大量合成镰刀菌酸（FA）。对FA生物合成基因研究发现，其为一分子天冬氨酸与聚酮链缩合修饰而成，该基因簇中不含NRPS基因，天冬氨酸激酶负责激活天冬氨酸并与聚酮链缩合，这种NRP/PK杂合次级代谢产物的稀有合成方式，反应非常新颖，可为药物或其他活性聚酮分子结构改造提供新思路。已在国内外相关专业期刊发表研究论文3 篇，申请发明专利1项；培养研究生4人。