传染性法氏囊病病毒蛋白酶VP4的高分辨率功能遗传图谱研究

Viral protease VP4 encoded by infectious bursal disease virus (IBDV), plays multiple important functions during IBDV infection by regulating virus replication, virion assembly, maturation and host immune response. However, little is known about the genetic basis for its functions, and the molecular functions of most amino acids (more than 95%) in VP4 protein are unknown. Conventional reverse genetics using site-directed mutagenesis is tedious and limits the genetically functional profiling of viral genome. Here we plan to develop a high-throughput genetic platform which taking advantage of saturation mutagenesis, reverse genetics and next generation sequencing (NGS). Saturated mutation will be introduced into each amino acid of VP4 and then multiple mutant libraries will be constructed to cover entire VP4 gene. After passaging in susceptible cells, NGS will be applied to analyze the differentially changed relative frequency of each mutation, to gain the high-resolution functional profiling for VP4 gene; After passaging in cell lines expressing host factors, functional domains for interactionswill be identified by analyzing the changes of relative frequency. This study systematically elucidates the biological functions of VP4 at single-amino acid level, identify the key region of VP4 for interaction with host factors, this study will be helpful to elucidate the molecular mechanism for IBDV replication.

传染性法氏囊病病毒（IBDV）蛋白酶VP4在病毒复制、组装、成熟和宿主免疫反应中发挥重要功能，然而，对于VP4发挥功能的遗传基础认识甚少，对于VP4蛋白的大部分氨基酸（95%以上）的分子功能尚不清楚。传统的基于定点突变的反向遗传系统费时费力，限制了病毒基因组功能的遗传学研究。本研究拟将饱和突变技术、病毒反向遗传系统和第二代测序技术（NGS）结合，建立一种高通量的病毒遗传学研究平台；在VP4蛋白每个氨基酸水平引入饱和突变，构建跨越VP4基因的多个病毒库；该病毒库在易感细胞中传代筛选后，采用NGS分析传代前后突变频率的相对变化，获得高分辨率的VP4蛋白功能图谱；突变病毒库在特定宿主因子作用下进行筛选，通过分析筛选前后突变频率的相对变化，鉴定VP4中与宿主因子互作的关键域；这一研究系统分析VP4单氨基酸水平的分子功能、鉴定VP4与宿主因子互作的遗传基础，对阐明IBDV的复制机制具有重要意义。

传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种感染禽类的重要免疫缺陷病毒，其编码的病毒蛋白酶VP4是一种多功能的蛋白，在病毒复制和调节先天免疫中发挥重要作用。本项目通过启动子选择、酶切连接策略、转染试剂等多个条件的优化，成功构建了相对高效的IBDV反向遗传系统；进一步采用NNK兼并引物法在VP4蛋白的氨基酸中引入饱和突变，测序证明突变的质粒文库构建成功，但突变文库拯救效果不稳定，突变病毒库的复杂度不能满足后续功能研究的需要；因此，通过对临床不同毒株VP4的遗传信息分析，VP4三维结构重构，翻译后修饰位点预测和鉴定等多个不同层面进一步分析VP4的功能位点，结果显示，VP4蛋白在170多个毒株中相对保守，能形成多聚体，其感染细胞中存在潜在的磷酸化、甲硫氨酸氧化、半胱氨酸棕榈酰化等多种翻译后修饰；VP4蛋白与宿主因子互作研究鉴定了VP4与宿主GILZ和CypA互作的结构域，并证明IBDV感染细胞中上调表达的IFIT5蛋白通过与VP1的互作调控IBDV复制过程。这些研究为阐明IBDV蛋白酶VP4的单氨基酸水平的功能以及IBDV与宿主细胞互作关系具有重要意义。