针刺调控VD大鼠海马星形胶质细胞活化增殖作用及其NLRC5-NF-κB信号机制研究

Ischemic cerebrovascular disease is the major risk factor for vascular dementia (VD). After ischemic injuries, astrocytes (AC) were firstly damaged, rapidly activated and proliferating, secrete large amounts of inflammatory factors and lead to neuronal death; astrocytes reactive gliosis, formate glial barrier, inhibit axonal growth, repair Neural circuits, and influence the reconstruction of nerve function..NF-κB is the core of the AC inflammation and the final effect channel of a variety of inflammatory factors inducing AC activation and proliferation, and play a key role in the development of VD neurodegenerative. NLRC5 is a key negative regulator of NF-κB pathway and can inhibit NF-κB-mediated inflammatory response. Preliminary studies found that acupuncture could reduce the neuronal apoptosis of VD rat hippocampal, inhibit AC activation and proliferation, and regulate NLRC5 and NF-κB expression..The current study intends to link NLRC5 and AC activation and proliferation, and observe the relationship and working mechanism between NLRC5 and VD rats hippocampal AC activation and proliferation, through flow cytometry, immunocytochemistry, molecular biology techniques. And the study was based on the same inflammatory response and the research platform of acupuncture effect. The current study intends to clarify the effects of NLRC5 on acupuncture regulation of AC activated proliferation and provide experimental evidence for the mechanism of acupuncture treatment for VD.

以炎症因子升高为特点的慢性胶质细胞活化，是血管性痴呆（VD）的重要病理特征。脑缺血后星形胶质细胞（AC）首先受损并活化增殖，分泌大量炎症因子，导致神经元死亡；本身还形成胶质瘢痕，阻碍轴突生长及神经功能修复。.NF-κB是AC炎症反应的核心及多种炎症因子诱导AC活化增殖的最后效应通道；NLRC5负调控NF-κB通路活性，抑制其介导的炎症反应。说明NLRC5-NF-κB-AC活化增殖间可能存在一定联系。我们预实验发现，针刺能抑制VD鼠海马AC活化增殖，减少神经元凋亡；良性调节NLRC5和NF-κB表达。证实上述联系客观存在，也提示针刺调节AC活化增殖的作用与NLRC5水平密切相关。 .因此本项目拟将NLRC5与AC活化增殖相联系，基于炎症反应这一相通环节，采用流式细胞术、免疫细胞化学、分子生物学技术，研究NLRC5在AC活化增殖中的作用及针刺影响。为揭示针刺治疗VD的作用机理提供实验依据。

目的：阐明NLRC5-NF-кB信号对血管性痴呆（VD）大鼠海马星形胶质细胞活化增殖的调控作用及针刺影响。.方法：（1）采用栓子注入法制造VD模型，并根据认知能力将VD鼠随机分为模型、针刺和非穴组。正常组不予任何处理；假手术组以生理盐水代替栓子溶液。针刺组给予针刺治疗。非穴组仅针刺双胁下两个固定非穴位点。其余各组行相同时间、相同程度的捉抓刺激。每日治疗1次，持续15天，每7天休息1次。采用Morris水迷宫检测认知能力；流式细胞仪分析海马星形胶质细胞（AC）的细胞周期。RT-PCR、WB、免疫荧光染色法测定GFAP、NF-кB、NLRC5 mRNA和蛋白等的表达。（2）对依前述方法造模并分组后的大鼠行侧脑室注射，其中假手术组注射无菌PBS溶液；模型和针刺组均注射siRNA溶液，每3天一次；正常组不做任何处理。造模同时各组给予相应治疗14天。后依次进行后续试验。.结果：VD鼠需要更多时间才能发现水下平台，采用的搜索策略效率也较为低下。针刺治疗后，大鼠能采用高效率的搜索策略在较短时间内发现目标。模型组海马AC异常活化增殖，表现为有较多AC细胞周期由G1期向S期转变。针刺能明显减少处于S和G2-M期的AC数量。VD鼠GFAP和p65的mRNA和蛋白表达及阳性染色细胞数量明显升高；而NLRC5 mRNA和蛋白表达水平显著降低。二者表达呈相反的变化趋势。针刺治疗能抑制GFAP和p65 mRNA和蛋白表达及阳性染色细胞数量；并提高NLRC5 mRNA和蛋白表达水平。siRNA干扰后，VD大鼠的认知能力进一步恶化。GFAP和p65的mRNA和蛋白表达及阳性染色细胞数量更多；而NLRC5 mRNA和蛋白表达水平更低。针刺治疗能反方向调节上述变化趋势。.结论：VD鼠学习能力、记忆保持能力和再学习能力均出现明显损伤。VD脑缺血损伤后，NLRC5表达受到抑制，而NF-κB则被持续激活并大量表达。NF-κB过度活化诱导AC活化增殖，使其重新进入细胞周期。针刺通过促进NLRC5表达来抑制NF-кB活化，进而减轻其诱导的炎症损伤，达到阻滞细胞周期、减少AC活化增殖、改善神经元生存环境，进而起到脑保护的作用。抑制神经炎症反应，阻止AC异常活化增殖可能是针刺改善VD鼠学习记忆能力的部分机制。