改造调控蛋白设计D-塔格糖信号分子及其功能验证

定向进化法是一种高效的蛋白质工程方法，包括构建目的基因的突变体文库，然后快速从突变体文库中筛选出少数具有某优良特性的突变体。目前构建数量庞大的突变体文库的方法已日趋成熟，最大瓶颈是缺乏高通量筛选方法。本课题将通过改造调控蛋白研制一种新颖的高通量筛选工具:信号分子。调控蛋白AraC将被改造成能特异性被D-塔格糖诱导并通过细胞荧光强度来反映细胞中D-塔格糖浓度的信号分子。为验证其功能，该信号分子将用作高通量筛选工具对L-阿拉伯糖异构酶进行定向进化法改造，提高该酶副催化反应产物D-塔格糖的产量。D-塔格糖是一种功能性甜味剂并对2型糖尿病具有可观疗效。该改造调控蛋白的方法可推广应用于定制结构相似的各种不同小分子化合物的信号分子，这些信号分子不仅将在研究化合物的生物合成中发挥重要作用，还可用于设计制作生物传感器或其他微量分析装置等。本课题对定向进化方法学研究和D-塔格糖生物合成研究都具有重要意义。

定向进化法是一种高效的蛋白质工程方法，包括构建目的基因的突变体文库，然后快速从突变体文库中筛选出少数具有某优良特性的突变体。目前构建数量庞大的突变体文库的方法已日趋成熟，最大瓶颈是缺乏高通量筛选方法。本课题探索了通过改造调控蛋白来研制一种新颖的小分子化合物高通量筛选工具：信号分子。调控蛋白AraC的诱导特异性被成功改造，不再响应其天然诱导物L-阿拉伯糖，转而被小分子化合物四氢嘧啶所诱导，开启启动子PBAD下游的荧光蛋白基因表达。该AraC突变体可以作为四氢嘧啶的信号分子使用，将细胞内部的四氢嘧啶浓度通过荧光蛋白的表达强度实时地反映出来。为了验证其功能，该信号分子被用作高通量筛选工具在大肠杆菌中对四氢嘧啶生物合成途径的关键酶EctB进行了定向进化改造，提高四氢嘧啶的合成产量。四氢嘧啶是一种渗透压补偿溶质，能在极端环境下对活细胞等大分子起到稳定和保护功能，其在制药、食品、化妆品、生物制剂、酶制剂等领域有着广阔的应用前景和开发价值。通过高通量筛选我们成功获得了比活力提高的EctB酶突变体，并发现大肠杆菌细胞的荧光强度与四氢嘧啶的合成产量具有较好的对应性。继而我们对这些EctB酶突变体的动力学参数进行了测定，发现它们对两种反应底物的亲和力和催化速度都有提高。研究证实了关键酶比活力的提高直接导致了四氢嘧啶生物合成产量的提高。通过对EctB酶的改造，我们将四氢嘧啶的生物合成产量提高了3倍以上。并且，由于这个方法不是直接筛选酶活力，而是筛选终产物的浓度，因此它还可应用于对合成途径其它酶以及基因组进行改造，来获得四氢嘧啶的高产菌株。本课题研究证明通过改造调控蛋白来设计小分子化合物的信号分子是切实可行的。本课题的研究经验可推广应用于打造其它小分子化合物的信号分子。这些信号分子不仅将在研究化合物的生物合成中发挥重要作用，还可用于设计制作生物传感器或其他微量分析装置等。本课题对定向进化方法学研究、小分子化合物的特异性识别、以及四氢嘧啶生物合成等研究领域都具有重要意义。