利用细胞膜选择性构建D-塔格糖高转化率的细胞模型

D-塔格糖作为一种低热量的甜味剂，广泛应用于食品工业中。L-阿拉伯糖异构酶可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖，但转化率很低，且底物的价格较昂贵。本项目的总体思路是以乳糖为底物，利用乳酸菌细胞膜对糖类吸收代谢的选择性，构建细胞模型，提高L-AI对D-半乳糖的转化率。首先利用基因敲除技术研究乳酸菌对乳糖、半乳糖的吸收代谢机制，敲除关键基因，提高乳酸菌对乳糖的利用率，并在细胞内积累D-半乳糖。然后将筛选得到的食品级L-AI基因通过基因整合的方式转入改造好的乳酸菌内，并筛选表达启动子，优化L-AI基因在乳酸菌中的表达。由于乳酸菌不能利用D-塔格糖，故将转化生成的D-塔格糖排放到细胞外，使转化反应向着生成D-塔格糖的方向进行。本项目通过对乳酸菌的糖吸收代谢机制进行研究，构建合理的细胞模型，为提高L-AI的转化率提供了一条新思路。该思路的提出对提高其他稀少糖类异构酶的的转化率也具有很重要的指导意义。

D-塔格糖作为一种低热量的甜味剂，广泛应用于食品工业中。本项目利用食品级L-阿拉伯糖异构酶（L-AI）构建能够生产塔格糖的乳酸菌细胞模型，提高转化率的同时确保安全性。.首先，我们通过菌种筛选的方式，获得一株能够生产L-AI的食品级微生物。根据生理生化实验以及16s rDNA系统发育树的结果，该菌被鉴定为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。我们克隆表达了该菌株的L-AI（PPAI）基因，并对其进行纯化。酶学性质研究表明，PPAI是一个中温偏酸性的异构酶，最适温度和pH分别为50°C和6.0；其活性必须依赖金属离子，Co2+对其有很大的激活作用。在最适条件下，当D-半乳糖浓度为0.5%时，PPAI的最大转化率可以达到52%。.本项目还克隆表达了来源于嗜热菌Anoxybacillus flavithermus的L-AI（AFAI）基因，该酶稳定性较高，但用于食品生产中并不安全。我们对PPAI和AFAI 进行晶体结构解析，但在尝试了6种样品条件和768种养晶条件后，均没有晶体生长。因此，通过同源建模和分子对接的方法，对PPAI的三维结构进行了预测，阐释了该酶的催化机制和底物特异性。.第二，我们对乳酸菌的乳糖、半乳糖转运代谢机制进行了研究。研究发现，商业化宿主菌乳酸乳球菌（L. lactis NZ9000）不能利用乳糖，但能利用半乳糖，利用率约为45%。实验室自行筛选得到的植物乳杆菌（L. plantarum）能利用乳糖，但对半乳糖利用较弱，利用率约为12%。因此，我们一方面利用商业化的乳酸菌表达系统构建PPAI的nisin诱导型表达菌株；另一方面，选用筛选得到的植物乳杆菌作为宿主菌，通过启动子筛选与优化，构建组成型表达PPAI的工程菌株。.第三，利用商业化乳酸菌表达载体pNZ8148，构建PPAI和半乳糖透性酶（galP）的共表达载体，将其转化到乳酸乳球菌NZ9000中。利用该工程菌株的静息细胞对半乳糖进行转化反应，有D-塔格糖生成，转化率38%左右。由于宿主菌能够利用半乳糖，导致转化率较低。同时，通过启动子文库构建以及强度测试，利用植物乳杆菌强启动子P14构建组成型表达载体pNZ8148-PPAIc，将其转化到植物乳杆菌中。此工程杆菌对半乳糖的转化率约为56%左右，比PPAI体外转化率有所提高，从而成功构建能够提高D-塔格糖转化率的细胞模型。