Notch信号通路：调控角膜内皮细胞增殖及分化的新靶点

如何调控角膜内皮细胞的增殖及分化一直是眼科领域的研究热点及难点，也是制约组织工程角膜发展的关键所在。研究显示Notch信号通路在角膜上皮细胞及血管内皮细胞向间质细胞分化中起重要作用，参与调节角膜上皮细胞及血管内皮细胞的增殖和分化。本课题组前期工作发现Notch信号通路存在于人角膜内皮细胞中，可能是调控角膜内皮细胞增殖及分化的新靶点。本项目以体外培养条件下的角膜内皮细胞增殖与分化为靶的，以正常供体角膜内皮细胞及临床角膜内皮病变标本作为研究对象，通过观察角膜内皮细胞增殖及分化过程中Notch信号通路的表达情况，以及干预Notch信号通路的激活对角膜内皮细胞增殖及分化的影响，阐明Notch信号通路调控角膜内皮细胞增殖及分化的可能作用机制，为体外培养可应用于临床的角膜内皮细胞提供理论依据，也为临床治疗角膜内皮病变提供一个新的思路。

本项目按照申请书要求从二个方面探讨了Notch 信号通路对角膜内皮细胞增殖和分化的调控作用。首先，选取不同年龄段正常人以及临床上角膜内皮病变患者的角膜供体材料，分离角膜后弹力层及角膜内皮细胞层，通过wholemount 免疫荧光染色、实时定量PCR、western blot方法检测Notch 信号通路受/配体、下游靶基因Hes1 的mRNA、蛋白以及间质细胞标记物α-SMA的表达情况进行了观察。随后通过体外培养HCEC细胞，Notch 信号通路调控体外培养增殖、分化的作用机制。结果发现，Notch 信号通路受体在正常人角膜内皮细胞层均呈阳性表达，但表达部位有所不同，Notch1 和Notch2 在细胞胞浆表达，Notch3 和Notch4 在细胞胞膜及胞核表达。Notch 信号通路配体中除Jag1 外，其余均为阳性表达，其中Jag2 在细胞胞膜上表达，DLL1 表达于细胞胞膜及胞核，DLL3 和DLL4 表达于细胞胞浆中。Notch 信号通路下游靶基因Hes1在角膜内皮细胞胞浆中表达。不同年龄段人角膜内皮细胞中Notch受体和配体的表达量存在明显差异，随着年龄增长，Notch受体和配体Jag2、DLL1、DLL3、DLL4的表达量显著增加；此外，不同年龄正常人角膜内皮细胞中Hes1蛋白表达量非常低；相同年龄组人群当中，角膜病变患者角膜内皮细胞中Notch受体和配体的表达量明显高于正常人群；异常人角膜细胞中Hes1和α-SMA表达增高；抑制HCEC细胞Notch信号通路显著降低Hes1和α-SMA以及p27kip1的表达，而细胞增殖相关蛋白Ki67表达水平有所增高；而细胞过表达Hes1基因上调p27kip1和α-SMA表达。以上结果表明Notch 信号通路在角膜内皮细胞增殖和分化中的作用。