珠母贝间液对珍珠质形成的分子调控机理

海洋双壳贝类的贝壳和珍珠是碳酸钙生物矿化的产物，因其优良的材料学特性及经济价值而备受关注。贝类矿化组织由外套膜、贝壳和间液组成。间液位于二者之间，是基质蛋白、矿化离子运输和贮存的主要场所，是碳酸钙矿化的微环境，对贝壳生长和珍珠质形成至关重要，但因其取材难、间液功能多样、组成复杂、研究手段单一等原因而研究较少，限制了贝类生物矿化机理研究的发展。本项目拟构建适用于间液的碳酸钙体外结晶实验体系，对间液中的生物大分子（蛋白质、糖蛋白、肽等）进行系统的分离鉴定和功能研究，初步筛选出间液中对贝壳生长和珍珠质形成起到重要的调控作用的生物大分子（或组分）2-3种，对其在贝类生物矿化中的调控作用及其机理进行深入研究。以期阐明珍珠质形成的分子机理，为珍珠生产提供理论指导。

间液位于贝类贝壳和外套膜之间，对贝壳生物矿化和珍珠质形成具有重要作用。本研究以合浦珠母贝间液为研究对象，利用多种方法研究间液对珍珠质形成的分子调控机理。间液体外结晶实验表明，间液蛋白对矿化前体离子具有荷载作用，能够抑制碳酸钙结晶发生。珠核体外结晶实验表明，在插入的珠核表面间液能够控制碳酸钙晶体以类似天然珍珠质片层的结构逐渐沉积。平板珍珠实验表明，外套膜分泌的基质蛋白可能通过间液和贝壳内层膜系统来调控文石晶体的成核和生长。运用HPLC疏水层析和LC-MS质谱鉴定，得到了57种间液蛋白，对其中重要的蛋白进行了进一步功能分析。其中，基质蛋白PfN23能够抑制幼贝发育，影响珍珠层形成，在体外蚕丝蛋白框架下诱导文石晶体形成；PfN44能够抑制文石小片过度生长，并在体外抑制文石形成，促进含镁方解石形成。结合糖基化染色和LC-MS鉴定，获得128条可能具有糖基化修饰的间液蛋白。其中，ACCBP能够通过形成两个五聚体组成的十聚体来稳定ACC的形成。同时，克隆并鉴定了软骨基质蛋白（CMP）和蛋白聚糖核心蛋白（ACP）两种糖蛋白，生物信息分析和缺刻实验表明其在贝壳修复中其作用。利用10KD超滤管、阴离子交换和LC-MS等方法对间液中的天然小肽（<10KD）进行分析鉴定，分别获得两种小肽：富含赖氨酸基质蛋白和DT252。研究结果显示，富含赖氨酸基质蛋白的新成员在合浦珠母贝胚胎发育的D型期、幼贝期和成体贝时期的外套膜组织中特异表达，RNAi抑制后可引起贝壳内表面显微结构异常；DT252则通过抑制碳酸钙晶体生长方向从而控制晶体有序生长，形成贝壳的精细结构。我们的研究成果深入阐释了间液及间液蛋白在贝壳及其珍珠质生物矿化中的作用，为揭示海洋生物矿化的分子机制提供了一定的证据，同时也能够为珍珠养殖生产提供理论指导。