生物矿化细胞对珍珠层形成的作用及其调控机制

The formation of the pearl is a typical biomineralization process, has a very important studying value. the mantle and pearl sac are the organs of the formation of of nacre, and their life activities along with the secretion of nacre form a pearl, decided to the quality of the pearl. The mechanism of the formation of the pearl has been the focus of attention by the people. We will use the pearl oyster Pinctada fucata, we isolated cells with continued division capacity from the mantle and pearl sac, to evaluate the growth and division activities in vitro, to explore the reason of the secretion of matrix proteins and the formation of the nacre in vitro; the use of cell biology analysis the exogenous irritants of proliferating cells in vivo, used to guide the optimization of culture medium, in order to obtain suitable medium; we established mineralization model of primary mantle and pearl sac cell culture for studying the regulation mechanism of the mineralized cells to secrete matrix proteins, initial screening the cell types play an important regulatory role in the formation of shell and nacre, and its regulatory role and regulatory mechanism of nacre biomineralization will reveal the mechanism of the mineralization cells in the formation of nacre ,we will get biological measures for the pearls production.

珍珠的形成是典型的生物矿化过程，具有十分重要的研究价值，外套膜和珍珠囊是珍珠质形成的器官，它们的生理活动伴随着珍珠质的分泌形成珍珠的过程，决定着形成珍珠的品质，珍珠形成机理的研究一直是人们所关注的重点。本课题以合浦珠母贝为研究材料，从外套膜和珍珠囊中分离具有持续分裂能力的细胞，评价其在体外生长分裂能力，探索其体外分泌基质蛋白和调控珍珠层形成的机理；筛选出促矿化细胞增殖的外源刺激物，用于指导培养基优化，以期获得适合贝类细胞增殖生长的培养基；建立原代外套膜和珍珠囊培养细胞矿化研究模型，用于研究矿化细胞分泌基质蛋白的调控机制，初步筛选出对贝壳生长和珍珠质形成起到重要调控作用的矿化细胞种类，并对其在珍珠质生物矿化中的调控作用和调控机理进行深入研究，揭示矿化细胞在珍珠质形成中的功能和作用机理，提出珍珠生产的生物学措施。

珍珠质是典型的生物矿化产物，具有良好的机械性能和生物相容性。目前普遍认为外套膜组织是负责沉积珍珠质的主要器官，因此研究外套膜对珍珠质的形成的调控作用一直是生物矿化领域所关注的重点。本课题以合浦珠母贝为研究材料，对外套膜组织进行离体培养，深入研究外套膜原代细胞对碳酸钙沉积的调控机理。我们首先对培养基进行改良，发现添加的四种脊椎动物源细胞因子：EGF、ECGS、IGF-1和bFGF均能显著提高原代培养细胞的活性、贴壁能力和迁移能力，并促进基质蛋白pif80、n16和accbp基因的表达（IGF-1对基质蛋白基因的表达有一定抑制作用）。通过密度梯度离心和流式细胞仪对离体的外套膜细胞进行分离，免疫荧光和western blot分析表明P2和P3组分为上皮细胞并且能表达KRMP、Pif80和Nacrein。同时，Real-time PCR分析也证实了体外培养的外套膜细胞保持合成和分泌基质蛋白（ACCBP、Pif80和Nacrein）的能力，另外细胞也保持着与贝壳形成相关的碱性磷酸酶和碳酸酐酶的高活性，表明离体培养的外套膜细胞保持了其作为矿化细胞的能力。偏振光显微镜和电子扫描显微镜发现细胞内分布大量的晶体颗粒物，FTIR和XRD技术证实该晶体颗粒物是无定形碳酸钙，锶离子标记显示外套膜细胞从头合成无定形碳酸钙，我们的结果显示外套膜细胞通过无定形碳酸钙进行生物矿化活动，可能直接参与合浦珠母贝贝壳的形成。此外，本项目研究还发现了合浦珠母贝血细胞在贝壳形成中的重要作用。我们首先完成了血细胞的分类鉴定并在间液腔中发现存在大量的血细胞。这些血细胞通过外套膜外表面的微孔进出间液腔。细胞总蛋白质谱分析鉴定了血细胞中的许多免疫和矿化相关蛋白成分。在注射脂多糖刺激和贝壳损伤刺激后，间液血细胞的免疫基因和矿化相关基因均有一定的响应。同时，偏光显微镜、扫描电镜和EDS分析发现部分血细胞能携带碳酸钙晶体，并出现在矿化前沿部位，表明血细胞可能同时参与了免疫和矿化。我们的研究建立了以外套膜原代细胞培养为基础的探究珍珠质形成机理的研究方法，阐明了对外套膜细胞和血细胞在贝壳生长和珍珠质形成中的重要调控作用，为提高人工育珠的质量提供了理论依据。