基于Cell-Free蛋白翻译系统的人工纤维小体构建和优化

纤维素是地球上最丰富的可再生资源之一，利用生物转化技术可将其转化为生物能源和生物基化学品。天然木质纤维素固有的结晶度高、不溶于水和可及性差等特性极大地降低了酶解效率、增加了处理成本，成为制约纤维素生物转化的关键瓶颈。纤维小体是自然界中最高效的降解纤维素的分子机器，然而天然纤维小体结构及组分复杂，利用厌氧微生物生产天然纤维小体具有产量低、成本高、工艺复杂、产物多变和难以产业化等缺陷。本课题应用合成生物学原理，建立纤维小体模块元件库，对酶分子、连接件、结合域等元件的基因进行标准化及模块化改造，借助高通量cell-free蛋白表达系统，高通量制备及筛选纤维小体元件，设计及优化含有3-5个高效酶组分的人工迷你纤维小体。最终筛选出针对特异性底物优化的高效最小人工纤维小体，为异源低成本高效率制备高活性的人工纤维小体提供必要的理论铺垫，从而为基于纤维小体的纤维素生物转化工艺奠定必要的技术基础。

纤维小体是自然界中最高效的降解纤维素的分子机器，然而天然纤维小体结构及组分复杂，利用厌氧微生物生产天然纤维小体具有产量低、成本高、工艺复杂、产物多变和难以产业化等缺陷。本课题应用合成生物学原理，通过建立纤维小体模块元件库，对元件基因进行标准化和模块化改造，获得了2-3个高效酶组分的人工迷你纤维小体，通过活性测定，组装的人工纤维小体比游离酶具有更高效的降解效率。本课题的主要研究结果有：（1）构建了热纤梭菌带Dockerin的纤维素酶基因库并进行了功能注释；（2）基于广泛使用的T7表达系统及同尾酶技术设计构建了一套基因构件快速多功能组装及表达系统,实现了对酶构件、连接件、粘附-对接模块等元件的基因进行标准化及模块化改造，目前本课题组已经获得了以pET28和pET30为骨架的12种通用载体；（3）获得了双功能和三功能人工纤维小体，组装的人工纤维小体比游离酶具有更高效的降解效率，酶组分的选择上增加了膨胀素，使得纤维小体与游离酶相比具有了更好的降解效率；（4）解析了来自丙酮丁醇梭菌的特殊纤维小体模块DocA和CohA2的结构和来自热纤梭菌I型dockerin的DOCT结构，通过结构的正确解析来进一步挖掘纤维小体模块间的相互作用力及作用位点。