发根农杆菌介导茶树等富多酚植物高频遗传转化分子机理研究

T-DNA of Ri plasmid in Agrobacterium rhizogenes transfered and integrated into the plant genome to produce multi-branch hair-root. Compared with conventional cell culture, hairy root culture is independent of the plant hormone, high-yield of secondary metabolites and genetic stability, Agrobacterium rhizogenes is not only an important tool for plant transgenic research, the hairy root culture also is expected to become an effective way for the industrialized biosynthesis of flavonoids and other health and medicinal ingredients. Many studies show that: tea plant and other polyphenol-rich plants have a strong inhibitory effect on microorganisms. This inhibitory effect is undoubtedly a bottleneck of the Agrobacterium-mediated plant genetic transformation and the use of hairy root culture technology for biosynthesis of plant active ingredients in large-scale. This study aimed to screen anti-polyphenol strains by plant polyphenols resistant culture, then to clone anti-phenol gene by subtractive hybridization and identificate the function. To proven the barrier factor of genetic transformation of Agrobacterium rhizogenes in polyphenol -rich plants and molecular mechanisms of high frequency induction to provide a theoretical basis for increase the rate of plant genetic transformation inducted by Agrobacterium rhizogenes and biosynthesis of active ingredients of plants,especially medicinal plants by the hairy root culture technology in large-scale. The research results will fill in the blank on the relationship between on Agrobacterium and ingredients contained in host plants at home and abroad .

发根农杆菌中Ri 质粒的T-DNA 转移并整合到植物基因组诱导产生多分支的发 根。与常规细胞培养相比，发根培养系具有植物激素自主性、次生代谢物的高产性和遗传稳 定性等优点，因此，发根农杆菌不仅是植物转基因研究的重要工具，其发根培养系也有望成 为工业化生物合成黄酮类等保健及药用成分的有效途径。但许多研究表明：茶多酚等植物富 含的多酚物质对微生物有强烈抑制作用。这种抑菌作用无疑成为农杆菌介导植物遗传转化以及利用发根培养技术工业化生物合成植物有效成分的瓶颈。本研究旨在通过植物多酚抗性培养筛选出抗酚性高的菌株，再利用差减杂交技术克隆抗酚基因并进行功能鉴定，以探明发根农杆菌对富多酚植物遗传转化障碍因子及高频诱导分子机制，为提高发根农杆菌对植物遗传转化率以及利用发根培养技术生物合成植物特别是药用植物有效成分的产业化提供理论依据。本研究成果也将填补国内外有关农杆菌与寄主植物内含成分相互关系研究的空白。

本研究利用儿茶素等植物多酚对发根农杆菌A4、K599、LBA5402、TACC15834进行了抑菌效果及筛选抗酚菌株研究，并对紫外诱变获得的高抗酚菌株和原始菌株（K599-AP和K599）进行了基因组测序，通过生物信息学分析，探讨抗酚菌株抗性形成及其对遗传转化高频诱导的分子机制。.1. 白藜芦醇等植物多酚对发根农杆菌的抑制作用研究结果表明，不同发根农杆菌对植物多酚的敏感性存在较大的差异，这也许是不同发根农杆菌介导植物特别富含抑菌成分的药用植物存在遗传转化频率较大差异的主要原因之一。.2. 发根农杆菌K599原始（Wild，W）和抗性（Resistant，R）菌株基因组分析：R菌株碱基总长度比W菌株长3.66亿，长度高出36.7%；；R菌株假基因为W菌株的近五倍，抗性与此是否相关有待进一步验证。.3. W菌株有物种Agrobacterium rhizogenes（160-3.22%），而R菌株缺乏该物种；R菌株的细胞壁/膜/包膜起源值（cell wall/membrane/envelope biogenesis）比W菌株稍高；R菌株缺乏代谢酶EC3.1.3.11，即磷酸戊糖途径中的果糖二磷酸酯酶（fructose-bisphosphatase，FBPase）。.4. 发根农杆菌K599原始和抗性菌株基因组表观遗传学分析表明：R菌株腺嘌呤甲基化（6-mA）和胞嘧啶甲基化（4-mC、5-mC）分别比W菌株高出7.4%和66.1%；被修饰的motif的数目（nDetected），基因组中该motif的数目（nGenome）以及motif的平均得分（meanScore）R菌株都远远高于W菌株，说明发根农杆菌的抗酚性很可能与此有关。.5. 将发根农杆菌原始菌株（K599）与抗酚菌株（K599-AP）基因组序列与NCBI数据库比对，发现抗酚菌株发生突变位点正好处于乙酰辅酶A连接酶（Acetyl-CoA ligase）区段，至于该特性的缺失与发根农杆菌抗酚性存在何种机制有待对发根农杆菌原始及抗性菌株基因组序列进行生物信息学与代谢途径更深入的分析。. 本项目取得的这些结果，为农杆菌介导植物特别是药用植物高效遗传转化，提高植物基因工程操作技术水平提供了科学依据，为利用植物特别是珍稀濒危药用植物发根培养体系生物合成有效成分，将传统植提行业升级为植物药生物制造产业开辟了广阔前景。