DNA甲基转移酶DNMT3L调控突触蛋白基因表达及其在唐氏综合征大脑皮层发育异常中的作用机制

Intellectual disability is the most profound neurological features of Down syndrome and studies on synaptic plasticity are essential to understand its pathological mechanisms. We recently observed global hypermethylation in the fetal brain of Down syndrome compared to that of normal people, and over-expression of chromosome 21 gene DNMT3L changed the expressions of some synaptic proteins (PSD95, APP). Thus we hypothesize that over-expression of DNMT3L causes global hypermethylation through stimulating DNMT3A and DNMT3B, or reduced methylation of histones related to active gene transcription through inhibiting histone methyltransferases; both may alter the downstream gene expression (APP, TP53, DLG4, et. al.) and cause some Down syndrome phenotypes including lowered synaptic plasticity and learning and memory deficits. Therefore, in the current project, we aim to build neural cell and animal models with three-copy DNMT3L, examine the genomic DNA methylation and gene expression, search for DNMT3L targeting genes, explore the molecular mechanisms of DNMT3L over-expression causing hypermethylation of targeting genes and altered gene expression, and observe its effects on abnormal neural development to prove the above hypothesis and provide theoretical and experimental basis for the early diagnosis and therapy of this disorder.

智能障碍是唐氏综合征最显著的神经表型；关于突触可塑性的研究是理解其发病机制的关键。最近我们观察到病人神经细胞基因组广泛的DNA甲基化增高现象； 21号染色体基因DNMT3L过表达能改变某些突触蛋白（PSD95、APP）的表达。因此我们认为过量表达的DNMT3L通过激活DNMT3A及DNMT3B使基因组整体的DNA甲基化增高，或者通过抑制组蛋白甲基转移酶使活跃基因转录相关组蛋白的甲基化降低，从而改变相关下游基因（APP、TP53、DLG4等）的表达，进而导致包括突触可塑性及学习记忆功能降低在内的某些唐氏综合征表型。为此在本项目中，我们拟制做三拷贝DNMT3L神经细胞及动物模型，检测基因组甲基化及基因表达，寻找DNMT3L的靶基因，探讨DNMT3L引发靶基因甲基化增高及基因表达改变的分子机制，观察DNMT3L过表达对神经发育表型的影响，证明上述假说的成立，为其早期诊治提供理论及实验依据。

唐氏综合征胎儿脑神经细胞基因组有广泛的DNA甲基化增高现象，在本项目中我们探讨了21号染色体基因DNMT3L是否通过增强DNA甲基化影响脑皮层发育。我们制做了DNMT3L 过表达人神经细胞、小鼠和果蝇，检测了基因组甲基化及基因表达，观察了DNMT3L过表达对脑皮层发育表型的影响，验证了DNMT3L 引发某些靶基因甲基化增高及基因表达改变的分子机制。主要研究内容有：1）在人流产胎儿的神经细胞过表达DNMT3L，通过甲基化芯片和RNA测序筛选出目的基因，研究DNMT3 L调控这些基因表达及其在神经干细胞分化中的作用机制。2）制作Dnmt3l条件过表达小鼠，通过内侧前额叶甲基化测序和RNA测序测序筛选出目的基因,进而利用神经细胞形态学鉴定、电生理检测和行为学检测进一步研究DNMT3 L调控这些目的基因表达及其在导致突触结构和功能改变、以及自闭样行为中的作用机制。3）制作转基因果蝇在神经细胞（elav+）过表达人DNMT3L，通过RNA测序并与小鼠的数据对比，筛选出突触相关蛋白的目的基因，进而通过神经细胞形态学鉴定和行为学检测研究DNMT3 L调控这些目的基因表达及其在导致突触结构和功能改变、以及学习记忆能力降低中的作用机制。结果显示：1）DNMT3L过表达通过增加STAT磷酸化调控下游转录因子及CDK抑制基因的表达，抑制神经干细胞增殖，促进神经细胞分化，这种机制与DNA甲基化无关，是DNMT3L作为协同蛋白功能的新发现。2）Dnmt3l条件过表达小鼠有自闭症样行为改变，神经元谷氨酸能受体表达增多，神经元突触结构异常，兴奋性增加；Dnmt3l通过改变组蛋白甲基化而影响突触谷氨酸受体表达,导致自闭症样行为。3）DNMT3L条件过表达果蝇在幼虫及成虫阶段的味觉学习记忆测试表明DNMT3L过表达降低其学习记忆能力，其转录组测序结果与Dnmt3l条件过表达小鼠转录组测序结果比较筛选出突触囊泡及通道相关的5个基因，与突触可塑性有关； Dnmt3l通过转录因子Esr1调控这些基因的表达。以上结果表明DNMT3L在神经发育过程中能通过结合转录因子或组蛋白甲基转移酶等非甲基化通路改变基因表达，影响神经分化和突触可塑性。