新疆犊牛腹泻病肠致病性大肠杆菌基因型调查及bfpA基因生物学功能研究

近几年新疆养牛业的发展呈现出强劲之势，但部分地区也出现了后备犊牛死亡率高、存栏数不足、购牛难的被动局面。为此加强犊牛繁育和疫病的防制工作就显得尤为重要。犊牛腹泻病是引起犊牛早期死亡的主要原因，直接给养牛业造成巨大的经济损失。本项目拟以新疆地区引起犊牛腹泻病中的肠致病性大肠杆菌（EPEC）为研究对象，选择高度保守的致病毒力基因（eae、bfpA），利用分子生物学技术，对新疆地区犊牛腹泻病中肠致病性大肠杆菌（EPEC）进行标准化分型，从基因水平阐明新疆地区犊牛腹泻病中肠致病性大肠杆菌（EPEC）的生物学特征，为该病的快速诊断奠定基础。同时对黏附基因bfpA的保护性功能和生物膜的形成及耐药性关系进行研究，为临床上准确有效防治由肠致病性大肠杆菌（EPEC）引起的犊牛腹泻病提供理论依据。

本课题主要以新疆南疆地区犊牛腹泻病致病性大肠杆菌进行研究，采样158份。经细菌分离、生化鉴定、血清学方法，得到大肠杆菌154株，占61%；沙门氏菌58株占23%，未鉴定的占16%。表明引起新疆南疆地区犊牛腹泻的病原菌主要是大肠杆菌。随机选取138株大肠杆菌分别进行eaeA（917bp）和bfpA(326bp) PCR鉴定和测序分析：所扩增eaeA与GeneBank中的eaeA完全一致；bfpA基因比对后完全不一致 。经克隆和和序列分析得到（eaeA+ bfpA-）的菌为106株，占76.84%. 表明该地区引起犊牛腹泻病中大肠杆菌的基因型主要是属于:非典型EPEC。. 利用96孔微量板法对106株(eaeA+，bfpA- )非典型性大肠杆菌进行生物膜的检测,得到生物膜阳性的25株，阳性率为23%。选择两株形成生物膜能力强的（7号菌和13-2），进行不同材质，培养基、培养温度、培养时间、不同浓度的葡萄糖（氯化钠、蔗糖 、硫酸镁）和pH值对其生物膜影响的研究。得出大肠杆菌生物膜形成条件为进口U96孔板、37℃、M9培养基、培养24-48h、pH为7.0-7.4。. 选择黄连、金银花、连翘、夏枯草、苦豆子、败酱草对7号大肠杆菌进行生物膜抑制作用分析。显示随药物浓度（0.25MIC、0.5MIC.MIC、2MIC、4MIC）的升高：黄连、苦豆子、金银花、连翘和败酱草在抑制细菌生长的同时也抑制细菌生物膜的形成；夏枯草在抑制细菌生长的同时生物膜的生长呈现增强的趋势，可能与夏枯草中的主要成分—甙类和果酸类改变了环境中的pH值，有利细菌生物膜的形成。. 利用PCR技术对25株大肠杆菌生物膜阳性菌株，进行生物膜形成相关毒力基因筛选。结果显示eaeA占100%，KpsMTII在占64%；其次是fliC占52%，，fimH占32%，大肠杆菌粘附结构fimH和fliC合计占84%；chuA占12%；bfpA、yja 和PapC均没有检出。表明bfpA基因与非典型EPEC生物膜形成无关。. 药敏实验显示25株生物膜阳性的非典型EPEC对诺氟沙星、环丙沙星的敏感率为41.8%，对头孢唑啉、庆大霉素和复方磺胺的敏感率为45-35%，对链霉素和红霉素的敏感率仅为9%。表明该毒力基因bfpA基因不是控制和主导细菌耐药性的编码基因。