葛根素与子宫内膜异位症雌激素受体结合后作用通路模式及其靶向性机制研究

子宫内膜异位症（Endometriosis, EM）是妇科领域重大研究课题。目前EM无理想的治疗方法，因此研制出具有知识产权的新药是妇科界的努力方向。我们的研究表明：葛根素明显抑制EM异位灶的生长，并通过下调芳香化酶P450（P450arom）转录因子AP-1 或 c-jun 水平抑制P450arom基因表达，减少雌激素的自分泌。根据植物雌激素的作用特点及我们的前期工作，提出葛根素可能是治疗EM的潜在药物，研究成果已申报专利。本项目拟采用质粒构建、RNA干扰技术、 Pull-down Assays、动物实验等方法，明确葛根素对EM异位内膜细胞雌激素受体（Estrogen receptor, ER）相关的转录辅活化子和辅抑制子的募集和调控作用，探讨葛根素对不同细胞中ER的经典ERE途径及非基因组效应的作用模式，阐明葛根素与ER结合后的作用通路及靶向性机制，为葛根素治疗EM的临床应用奠定基础。

本项目探讨葛根素与子宫内膜异位症（Endometriosis, EM）雌激素受体结合后作用通路模式及其靶向性机制。结果表明：（1）在缺乏ER的HeLa 细胞中，葛根素与雌激素对ERE报告基因没有转录激活作用；而将ER或ER表达质粒与ERE荧光素酶报告基因质粒共转染HeLa 细胞中，葛根素和雌激素均可明显诱导ERE荧光素酶报告基因转录激活，且呈现明显的剂量依赖效应；而且雌激素受体拮抗剂ICI182780 可阻断葛根素和雌激素的转录激活作用。这些实验结果表明，异黄酮类植物雌激素葛根素与雌激素的转录激活作用是依赖于ER存在的。且低浓度植物雌激素(10-9 mol/L葛根素)只能通过ERβ激活ERE报告基因的转录，而对过表达ERα的HeLa 细胞则没有明显作用，提示葛根素与ERβ亲和力更高，低剂量葛根素具有选择性结合ERβ并激活ERβ介导依赖的相关基因转录。（2）葛根素能与E2竞争性结合ER，其竞争能力约是雌激素的1/3，其相对结合亲和力32.2%。（3）体内实验结果进一步显示葛根素可显著抑制异位内膜组织的生长，且作用具有靶向性。葛根素通过调节P450arom、COX-2、17β-HSD2、17β-HSD1的表达，降低异位内膜组织PGE2、E2水平，阻断自分泌雌激素的正反馈作用，促进E2代谢，抑制异位内膜组织生长。同时，体外实验表明：葛根素通过促进E2依赖的SMRT、NCoR的募集、减少SRC-1、SRC-3的募集，下调cyclin D1和cdc25A 表达，阻滞细胞于细胞周期G1，从而抑制ESCs的增殖。葛根素还可抑制ESCs的侵袭、异位病灶血管生成，达到治疗EM的作用。（4）葛根素能通过非经典的mER途径，抑制由E2激活的ERK信号通路，抑制cyclin D1、COX-2及CYP19的表达。（5）E2和葛根素对成骨细胞的促增殖作用主要是通过ERа；E2对RANKL和OPG mRNA的调控作用是由ERа及ERβ协调完成，葛根素则是由ERβ和膜受体介导；葛根素能够显著抑制E2对ERа共激活子的募集；减弱E2对NcoR1的募集的抑制作用。（6）葛根素对性成熟期小鼠的生殖系统有一定的影响作用，葛根素因剂量的不同发挥类雌激素和抗雌激素的双重作用。妊娠期雌鼠予葛根素灌胃后对母鼠及子代小鼠均无明显不良影响，即葛根素不存在明显的胚胎-胎仔发育毒性。