Pseudomonas K-62 抗汞操纵子在烟草中的表达分析

In Pseudomonas K-62, mercury was transported into cell by merT-merP. Methylmercury was transformed into Hg2+ by merB1 and phenylmercury was transformed into Hg2+ by merB2. Hg2+ was chelated with polyphosphate which was encoded by polyphosphate kinase gene ppk. The chelate was stored in cell. To resolve the problem that much agricultural soil has been polluted by mercury, we plan to construct the plasmid p(merR-o/p-merT-merP-merB1-merB2-ppk）on the base of our previous work. We are going to insert the modified mer operon into pCAMBIA3300 and transformed into tobacco NC89 through Agrobacterium. We will characterize whether the modified Pseudomonas K-62 mer operon can be transcripted and translated, ensure if Klebsiella aerogenes polyphosphate kinase gene ppk can catalyze, synthesize polyphosphate and chelate with Hg2+. The mercury tolerance of the transgenic tobacco, mercury content and the mercury form in the transgenic tobacco will be analysed. The possibility that the polluted soil is recovered with the transgenic tobacco will also be evaluated.

在Pseudomonas K-62中，merT-merP将有机汞和无机汞运输到细胞内，merB1编码的甲基汞裂解酶将甲基汞降解为二价汞，merB2编码的苯基汞裂解酶将苯基汞转化为二价汞，二价汞被ppk编码的聚磷激酶调控合成的磷聚合物螯合并储存在细胞中。针对我国农田土壤大面积被汞污染的问题，我们计划在前期工作基础上，构建质粒p（merR-o/p-merT-merP-merB1-merB2-ppk）。将修改后的mer操纵子插入pCAMBIA3300, 通过土壤农杆菌将修改后的mer操纵子转化到烟草NC89中，确认Pseudomonas K-62抗汞操纵子能否在烟草中转录、翻译，研究Klebsiella aerogenes聚磷激酶基因ppk能否在高等植物中发挥催化合成磷聚合物的功能，分析转基因烟草对汞的耐受性、转基因烟草中汞的含量及存在形态，评估转基因烟草应用于修复土壤汞污染的可行性。

汞是一种有毒重金属。土壤中的汞最终会通过农作物或食物进入人体，对人类造成危害。为了构建汞积累烟草，我们构建了p(merT-merP-merB1-merB2-ppk)和p(merT-merP-merB1-merB2-pcs1)两个转化载体。MerT、merP、merB1和merB2均来自Pseudomonas K-62抗汞操纵子。Ppk来自产气克雷伯杆菌Klebsiella aerogenes。该基因编码聚磷激酶。Pcs1是一个烟草螯合肽合成酶基因。它所编码的植物螯合肽合成酶在植物螯合肽合成过程中发挥了关键作用。通过对普通烟草转化，我们获得了两个能够正常开花结实而且株高与野生型相仿的转基因株系Ntk-7（转化p(merT-merP-merB1-merB2-ppk)的烟草）和Ntp-36（转化p(merT-merP-merB1-merB2-pcs1）的烟草）。无论对于有机汞还是无机汞，转基因株系的汞耐受能力和汞积累能力都显著高于野生型。Ntp-36的汞积累能力优于Ntk-7。目前对于植物吸收汞的机制并不清楚。一些研究暗示，植物运用同一套机制吸收汞和镉。为了验证这些猜想是否正确，我们对烟草重金属ATPase基因HMA3进行RNAi分析。该基因在植物对镉的耐受机制中发挥了关键作用。结果显示，转基因NtHMA3a-NtHMA3b-RNAi植株、转化空载体的转基因植株和野生型对汞的耐受能力和积累能力没有显著差别。表明植物中控制吸收汞的基因不是HMA3,很可能是ABC转运蛋白基因。农田中的汞多数是由工厂废水灌溉引起的。防止农田汞污染的最佳办法是在这些废水从工厂排出以前进行脱汞处理。为了达到该目的，我们构建了一个人工操纵子P16S-g10-merT-merP-merB1-merB2-ppk-rpsT和一个工程菌BL21-7。该工程菌对氯化汞、氯化苯基汞和氯化甲基汞的耐受能力分别为100 µmol/L、80 µmol/L 和60 µmol/L。在含有80 µmol/L 氯化汞的LB培养液中培养72小时以后，工程菌汞积累达到70.5±1.5 µmol/L。在工业废水中，汞与镉总是相伴存在。在构建除汞工程菌的同时，我们也构建了一个除镉工程菌。该工程菌对镉的耐受能力和积累能力都显著高于野生型。