贻贝粘合蛋白Mefp-5在烟草中的表达与功能评价

The development of new-type, high cohesive-strengh and non-toxic bioadhesives is becoming an important research area because of their versatile application in stomatology and clinical orthopaedics. Recent studies have shown that adhesives extracted from mussels or prepared by genetic engineering proves to be with great cohesive strength and biocompatibility, showing great clinical prospect. However, low yield of the recombinant cohesive proteins failed to meet the large scale productive requirement according to recent reports and our previous research. Having constructed the transgenic plant with mytilus edulis footprotein-5 gene (Mefp-5) using Agrobacterium, we intend to explore the more effective method for enhancing the expression efficiency of Mefp-5 by screening highly-expressed strains and optimizing expression conditions and efficient method for purifying the recombinant mytilus edulis footprotein-5(Mefp-5) through affinity chromatography. And then, the cohesive strength and biocompatibility of Mefp-5 are evaluated through cytological, animal and biomechanics experiments. This study would provide experimental support for the large-scale preparation for albuminoid adhesive with great cohesive strengh and biocompatibility using transgenic plants.

医用粘合剂在口腔医学和骨科临床具有广泛的用途，探索新型高强度、无毒的生物粘合剂是生物材料研究领域的重要方向。近年来的研究表明，天然提取和基因工程技术制备的贻贝粘合蛋白不仅具有湿性粘结能力，而且其粘结强度高、生物相容性好，因此具有良好的临床应用前景。然而，文献报道和我们前期的工作均显示使用大肠杆菌和酵母作为宿主表达重组贻贝粘合蛋白的效率极低，难以满足规模制备的要求。本项目拟在前期使用农杆菌介导方式获得贻贝粘合蛋白Mefp-5转基因植株的工作基础上，通过筛选高表达植株、优化表达条件等手段，探索使用植物宿主高效表达重组Mefp-5蛋白的方法，并使用亲和层析方式加以纯化和精制，获得高纯度的重组Mefp-5蛋白，进而利用细胞学实验、动物学实验和生物力学实验对该重组蛋白的生物相容性和粘结强度进行系统评价，最终为使用转基因植株规模制备同时具有高粘结强度和良好生物相容性的优质蛋白类粘合剂提供实验依据。

目前投入临床使用的大多数医用粘合剂均具有粘结强度低、降解产物有细胞毒性以及原材料来源于动物有潜在病毒性疾病致病风险等缺点。因此研发新型高强度、无毒生物粘合剂是口腔医学和骨科临床的重要研究领域。贻贝丝足蛋白是一类由贻贝分泌具有湿性粘结能力的粘合蛋白质，近年来使用基因工程技术制备该类蛋白也被证实具有良好的粘结强度和生物相容性。然而，由于文献报道以大肠杆菌和酵母作为宿主表达的重组贻贝丝足蛋白-5(Mgfp-5)表达量均极低，尚不能满足规模制备的需求。针对这一问题，本研究构建了贻贝粘蛋白Mgfp-5的植物表达载体，并应用农杆菌介导法对烟草、菊苣等作为受体植物进行了遗传转化。历经离体再生、抗性筛选及培养，进而通过PCR、RT-PCR、Western blotting等分子生物学鉴定，分别成功获得了能够表达Mgfp-5的转基因烟草和菊苣株系及大量转化细胞系。而后，通过扩大培养两种转基因植物并尝试诱导培养转基因烟草愈伤组织，可以得到稳定表达Mgfp-5的植物体或者植物组织，拓宽了获取重组蛋白Mgfp-5的原材料途径；培养、纯化并制备植物重组蛋白Mgfp-5，分析其粘接强度等功能（如植物重组蛋白Mgfp-5在体外不需要修饰可以具有较好粘接性能），正在进一步通过细胞学实验和生物力学实验等科学评价该重组蛋白的生物相容性和粘结强度，为重组蛋白的应用提供实验依据，并为优质蛋白类粘合剂材料（贻贝粘合蛋白）的来源提供生物技术新途径，推动植物基因工程及医用粘合剂应用的深入研究。