双组分信号转导系统YycG/YycF对表皮葡萄球菌生长存活和生物膜形成的调控机制

表皮葡萄球菌是医院感染的重要病原体，可形成生物膜顽固粘附于植入性医疗材料表面，造成慢性、持续性感染，已成为临床治疗难题。双组分信号转导系统YycG/YycF是葡萄球菌生长繁殖所必需；针对YycG组氨酸激酶的抑制剂可破坏表皮葡萄球菌生物膜结构并杀灭其中的细菌，表明YycG/YycF对细菌存活和生物膜形成具有重要调控作用，但调控机制仍不清楚。本项目拟使用反义RNA技术，构建表皮葡萄球菌yycG/F条件性基因沉默菌株，将基因芯片、蛋白质组学与相关生物学实验相结合，在细菌表型、转录组和蛋白质组水平研究基因沉默株与野生株的差异，结合生物信息学方法寻找YycG/YycF调控的细菌必需基因和生物膜形成相关基因、并研究其生物学功能。本研究将揭示YycG/YycF信号转导系统对细菌存活和生物膜形成的调控机制，进而阐明YycG组氨酸激酶抑制剂的杀菌/抗生物膜机制，为新型抗菌/抗生物膜药物的研究奠定理论基础。

双组分信号转导系统YycG/YycF在细菌生长和生物膜形成中发挥重要的调控作用，针对表皮葡萄球菌YycG/YycF的抑制剂具有杀菌/抗生物膜活性，然而YycG/YycF生物学调控机制尚不明确。本项目对表皮葡萄球菌YycG/YycF调控细菌生长及生物膜形成的分子机制进行了研究：. 首先，采用asRNA技术诱导yycG/yycF条件性基因沉默，并比较了诱导/未诱导条件下菌株生物学表型的差异，发现细菌的生长和生物膜形成受到明显抑制，而细菌经Triton X-100诱导的自溶明显增强。进而对YycG/YycF所调控下游基因的生物信息学分析，发现16个YycF可能结合的启动子DNA位点；并通过qRT-PCR检测了asRNA沉默yycG/yycF后，可能的下游基因的转录水平变化。纯化了YycF蛋白并通过凝胶迁移阻滞实验对所预测的YycG/YycF可能调控的下游基因qoxB、pstS和sceD进行了验证，并用DNase I footprinting验证了YycF蛋白的结合位点。通过asRNA沉默yycG、yycF或下游效应基因qoxB、pstS和sceD基因，发现影响细菌生长、自溶和生物膜的形成，为YycG/YycF系统调控细菌生长和生物膜形成的可能机制。对YycG抑制剂先导化合物的活性基团进行优化改造，设计并合成了一系列结构新颖的YycG抑制剂衍生化合物，获得了抑菌杀菌活性、抑制生物膜形成和杀伤生物膜内细菌能力明显增强、毒性下降的衍生物；进一步建立了动物模型，发现YycG抑制剂在动物体内对生物膜内表皮葡萄球菌具有良好的杀菌效果，为新型抗表皮葡萄球菌生物膜感染药物的研发打下一定基础。. 通过本项目的开展，承担单位一共发表SCI收录论文6篇，并建立了与德国图宾根大学微生物遗传学系的国际合作，参加国际学术交流1次，培养研究生3名；达到并超过的预定指标。