Zebularine诱发植物染色体结构变异的研究

Zebularine has an effect on reducing the methylation level of genomic DNA which could result in decondensation of heterochromatin and chromosome structrual variations of Triticale, particualrly, it can induce intercalary translocations indicating potential use in plant chromosome engineering. In this project, effect of zebularine inducing chromosome variations in seeds, tillers and spikes at meiosis stage of the octoploid Triticale Jinghui 1 and its two parents wheat cultivar Huixianhong and Chinese rye cultivar Jingzhouheimai will be investigated and compared in order to develop a new method to induce chromosome variations in cereal crops. Combined with sequential and multicolor FISH and molecular marker analysis, chromosome variation types and frequencies, and its relationship with various repetitive sequences and methylation level will be analyzed, and mechanism will be proposed. Small segmental translocations involved chromosome 6R will be targetly induced and used for further mapping the resistance genes, developing new germplasm and validating the effect of zebularine in practical application.

前期研究表明，Zebularine作为一种DNA甲基转移酶抑制因子能够通过降低DNA甲基化水平，影响DNA的稳定性并导致系列小麦-黑麦染色体结构变异，具有诱发中间插入易位等小片段易位的效应。项目拟利用此特点，以选育的小麦-黑麦双倍体及其小麦、黑麦亲本为材料，通过处理种子、分蘖期和减数分裂期植株，揭示该药品诱发不同倍性物种染色体变异和表型突变的效应，建立一种高效快捷的诱发植物染色体结构变异特别是小片段易位的新方法；利用多色和顺序FISH/GISH技术，鉴定诱变当代及自交后代的染色体变异类型与频率，分析断裂-重接位点与重复序列及甲基化水平的关系；以二体附加系DA6R为试材，定向诱致涉及6R染色体的各类易位，区段定位其高抗白粉病基因并选育新的易位系。

首先，以中春国非整倍体为基础，通过寡核苷酸探针套painting建立了可以清晰识别小麦全部染色体的高清参考核型，可以识别300多个小麦品种和5个亲缘物种的染色体多态及其结构变异，将寡核苷酸painting和基因组原位杂交结合，可以同时识别小黑麦基因组中的全部染色体，为分析zebularine诱变效应提供了简单、高效和可靠的工具；其次，以小黑麦荆辉1号为材料，通过zebularine浓度和处理时间比较，建立了干种子浸泡、孕穗期注射和分蘖期浸泡三种诱变方法，发现zebularine可有效诱发染色体变异，包括端体、无着丝粒断片、缺失、易位、环状和多着丝粒染色体等；通过对3055条变异染色体分析发现，不同基因组和染色体敏感性存在差异，R组染色体变异频率最高，其次为B组，A组和D组染色体变异率相对较低；对染色体而言，5A、6R、7R、7D、4A、6B变异明显较高，而1A、3R、7B、6D、6A、2R变异明显较低，其它染色体介于两者之间，其中重复序列pSc119.2-1和(AAC)10区域可能涉及断裂-重接热点，而多着丝粒染色体的频繁形成暗示断裂-融合-桥（BFB）循环可能是结构变异的重要来源；第三，从诱变处理自交后代中均获得了可以稳定传递的系列变异体，并创制了以荆辉1号为背景的染色体变异库，涉及黑麦全部和多条小麦染色体，包括一套黑麦染色体缺体和系列端体、缺失和易位系；第四，发现zebularine可以有效诱发六倍体小黑麦、小麦辉县红、小麦-黑麦二体附加系DA6R和小麦-百萨偃麦草附加系DA4J染色体变异；通过RNA-seq，开发了401个黑麦染色体特异标记，并对获得的部分荆辉1号变异体进行了验证，构建了包含26个特异标记的6R物理图谱，并区段定位抗白粉病基因于6RL-2；最后，组配了抗病易位系与不同小麦栽培品种的杂交组合，并从F3中鉴定出以烟农19为背景的抗白粉病单株14株，为更好地转移和利用荆州黑麦6R抗病基因提供了新材料。