纳米免疫磁珠富集结合液相色谱-质谱检测的溶酶体脂质组分析方法研究

Omics study at subcellular level is a new way to explore the undiscovered cell processes. In 2017, liquid chromatography-mass spectrometry based lysosomal metabolomic studies were published by the prestigious journal Science and Cell. However, this newly reported method has very limited capability for the detection of lysosommal lipids. Although the trafficking and degradation of lipids in lysosome is closely related to the cell process (autophagy, inflammatory response, etc.), lysosomal lipidomic method has not been established yet. Our previous studies showed that antibody of lysosomal membrane protein LAMP1 can selectively bind the lysosomes, and that lipid standard samples can be successfully separated by mixed-mode chromatographic columns. Therefore, this project will prepare anti-LAMP1 conjugated immunomagnetic nanobeads for the enrichment of lysosomes and also develop a mixed mode liquid chromatography-mass spectrometry based method for the separation and detection of lysosome lipids, and establish the lysosomal lipidomic study based on the above two methods. Then, the lysosomal lipidomic method will be used for profiling lipids in lysosomes of human lung adenocarcinoma cells, which are under nutrient replete conditions. This project will fill the gap of lysosomal lipidomic studies and promote the understanding of the mechanisms regarding adaption of nutrient starvation for tumor cells.

亚细胞层面的组学分析是探索细胞生命过程的新途径。 2017年，Science和Cell首次报道了基于液相色谱-质谱的细胞线粒体、溶酶体代谢组学研究，然而该方法对疏水性脂类物质的分析能力有限。尽管溶酶体内脂质分子的转运代谢与细胞生物学过程（自噬、炎症等）及癌症等疾病密切相关，然而截止目前，国际上溶酶体脂质组研究技术尚属空白。溶酶体的特异性富集及脂质分子的高效分离是其主要的技术瓶颈。申请人前期工作发现了LAMP1抗体对溶酶体的特异性识别及混合模式色谱在脂类物质分离中的潜在优势。因此，本项目拟制备偶联LAMP1抗体的纳米免疫磁珠以实现对溶酶体的特异性富集，发展混合模式色谱-质谱的脂质分子分析检测技术，从而构建溶酶体脂质组的研究方法；利用该方法比较营养充足与缺乏条件下肺癌细胞溶酶体脂质组的差异。本项目的实施有望填补溶酶体脂质组研究技术的空白，拓展对肺癌细胞营养缺乏适应性机制的理论认识。

如何对溶酶体内的脂质进行系统的分析鉴定是当前生物分离分析中一个重要的科学问题，溶酶体的特异性富集和复杂脂质的高效分离检测是实现溶酶体脂质组分析的关如何对溶酶体内的脂质进行系统的分析鉴定是当前生物分离分析中一个重要的科学问题，溶酶体的特异性富集和复杂脂质的高效分离检测是实现溶酶体脂质组分析的关键技术瓶颈。本项目针对这两个技术瓶颈主要完成了以下内容：1）考察一系列纳米磁性颗粒可能的生物学效应，筛选了生物安全性较好的磁性纳米材料用于构建溶酶体富集方法；2）发展复杂脂质样品的色谱-质谱分析检测技术，结合溶酶体富集方法构建了溶酶体脂质分析方法，探索了环境污染物长期暴露对细胞内溶酶体稳态及脂质代谢的干扰。项目研究过程中主要获得了以下重要结果：1）首先，研究发现纳米磁珠可引发一定的细胞生物学效应，包括炎症效应和改变细胞的迁移能力等，且不同的材料理化特性对特定的一个生物学效应的影响程度有很大差异。该发现在国际Top期Nat. Commun.上发表。2）纳米材料在复杂生物体系中的生物转化可能是导致纳米免疫磁珠毒性效应和富集效果的重要因素，因此对纳米材料生物转化及其可能机制进行了探索，并系统讨论了纳米-生物作用界面、暴露途径对纳米材料生物转化和生物效应的影响，以及表面涂层、形貌控制、掺杂及表面钝化等纳米材料表面安全性修饰方法对改善生物转化的作用。该成果在国际重要期刊Small上发表。3) 对无定形纳米氧化硅长期暴露后的巨噬细胞的溶酶体进行了富集，考察了暴露前后溶酶体蛋白组以及脂类物质的变化，结果发现无定形纳米氧化硅长期暴露不仅可导致细胞中溶酶体数量和大小发生改变，还可使溶酶体中的蛋白和脂类物质的含量发生变化，干扰溶酶体稳态和细胞自噬，进一步导致脂类包括胆固醇代谢的紊乱，造成细胞中脂类的累积。该成果在国际重要期刊Environ. Sci. Nano上在线发表。