小反刍兽疫病毒非结构蛋白与Ⅰ型干扰素相互作用机制研究

小反刍兽疫病毒是一类严重威胁我国畜牧业可持续发展的动物病毒，其磷酸化蛋白通过RNA编辑产生两种非结构蛋白V/C，在对副粘病毒的研究中，这类蛋白可抑制I型干扰素的生成，因而在病毒感染细胞的过程中具有重要作用。本研究通过构建表达单一非结构蛋白的非融合慢病毒载体，获得病毒后感染不同来源细胞系，在基因及蛋白水平上分析磷酸化蛋白RNA编辑所产生的非结构蛋白对干扰素分泌的影响，并利用反向遗传学技术，通过定点突变沉默辅助质粒磷酸化蛋白中的V或C蛋白，分析不同非结构蛋白对转录复制效率及I型干扰素的影响，完成细胞水平上的分析，通过这两方面的分析，全面了解其对天然免疫中I型干扰素的影响。本研究将有助于了解小反刍兽疫病毒免疫识别与逃避制机，并促进小反刍兽疫病毒新型疫苗的开发利用，因而对本病的防控具有重要的理论及实践意义。

研究小反刍兽疫非结构蛋白与天然免疫的关系，本研究首先克隆了羊的干扰素基因，明确了该基因由一个561碱基编码186个氨基酸，大小为36 ku的蛋白，通过基因组信息及蛋白信息分析表明，羊IFN-β由一个22信号肽组成，包含两个糖蛋白位点，通过荧光定量分析表明，该基因主要分布于淋巴、脾脏等组织器官中，肾、皮肤及其它组织有少量组成形表达；全基因合成gSLAM基因克隆至真核表达质粒pIRES2-GFP，构建重组质粒pIRES2-gSLAM。将该重组质粒转染非洲绿猴肾细胞，筛选到稳定表达gSLAM基因的细胞系Vero-gSLAM，该细胞系在传代至第10代，仍能稳定表达gSLAM蛋白，小反刍兽疫病毒株N75/1可以感染且能形成明显的细胞病变，相比在Vero 细胞上10-4.65 TCID50/0.1ml的毒价，在Vero-gSLAM上为10-5.75 TCID50/0.1ml，表明该细胞系可用于PPRV强毒分离和致弱机制等相关研究；从小反刍兽疫病毒全长cDNA中对磷酸化蛋白P及其编码的非结构蛋白V基因进行特异扩增后将其亚克隆至真核载体，荧光定位观察表明P蛋白与V蛋白的表达并不相同，P蛋白严格定位于细胞浆，而V蛋白则能在胞浆及胞核内观察到；获得原核表达质粒诱导后分别收获细胞上清及沉淀用于SDS-PAGE及Western blot对重组P、V蛋白的检测，结果表明重组P蛋白为90ku，重组V为55ku的可溶性融合蛋白；构建了小反刍兽疫病毒(PPRV) 辅助质粒和微型复制子并进行功能学研究，构建完成的微型复制子及辅助质粒在表达 T7 RNA多聚酶感染痘病毒VTF7-3后通过脂质体法优化四种质粒配比并将其转染至Vero细胞，通过间接免疫荧光分析CAT的表达情况，荧光显微镜观察到荧光的表达，并通过免疫印迹分析CAT蛋白的表达，构建了具有转录和复制功能PPRV微型复制子；小反刍兽疫病毒早期感染细胞后完成转录组深度测序分析，通过数据库的分析比对，在GO及KEGG两个通路中分析到下列细胞因子参与了病毒在早期感染过程中起调控作用，细胞对病原刺激所产生的差异表达包括趋化因子：CCL2、CXCL8、CCL5、CXCL10 干扰素诱生蛋白：IFIT3、ISG20、ISG15、IF44；细胞对病原刺激所产生的信号转导分子差异表达为泛素USP18。通过差异基因GO富集分析表达下调PTMS，FGF21。通过差异