转菰ZR1基因水稻的抗病性及其抗性分子机理研究

菰[Zizania lattfolia (Griseb.)] 系禾本科稻族菰属的一个种，具水稻栽培品种所需的抗稻瘟病、纹枯病和白叶枯病等优良性状。本课题组从菰基因组TAC文库中筛选到含NBS-LRR类抗病基因（暂定名为ZR1）的阳性克隆，并通过根癌农杆菌介导，将该阳性TAC质粒（插入片段6 kb左右）成功转入水稻粳稻品种日本晴的成熟胚愈伤组织，最终获得对白叶枯病菌PXO71有显著抗性的转菰ZR1基因日本晴T2代种子。本研究拟对转菰ZR1基因日本晴进行抗白叶枯病和稻瘟病检测，以期明晰其抗谱并筛选到对1种（或2种）病害有较强稳定抗性的转菰基因后代；通过对ZR1基因的分离、结构分析以及组织表达特征和亚细胞定位等研究，以期探明转菰ZR1基因水稻的抗病分子机理。本研究的成功实施，可望获得高抗病转菰基因水稻新品系和新型抗病基因，并揭示其抗病分子机理，为新型抗病水稻品种选育提供新思路和奠定新的理论基础。

RACE法克隆了ZR1基因CDS全长3237 bp；染色体步移法获得了ZR1基因ATG上游2000 bp启动子区。序列分析结果显示，菰ZR1基因编码蛋白含1个NB-ARC结构和1个抗病蛋白专属功能域，其启动子区也包含抗逆相关基序。构建了ZR1基因过表达载体、ZR1基因自身启动子驱动的表达载体，ZR1基因启动子连接报告基因gusA的表达载体，并分别转化粳稻品种日本晴，获得转基因后代。RT-PCR和组织化学染色分析结果显示，菰ZR1基因主要在地上部分表达。亚细胞定位结果表明，ZR1基因可能编码一个膜蛋白。白叶枯接种抗性鉴定结果显示，转菰ZR1基因过表达载体日本晴后代、转ZR1基因自身启动子驱动的表达载体日本晴后代与对照日本晴无显著差异。采用酵母双杂交技术从水稻cDNA文库中筛选与 ZR1互作蛋白基因，将pGBKT7-ZR1 诱饵表达载体与 pGADT7-cDNA文库共转化酵母AH109，通过顺序检测报告基因HIS3、ADE2的表达，共筛选获得9个UniGene。克隆了鄱阳湖流域30个野生菰群落的ZR1基因以及日本晴、IR24、JG30中ZR1同源基因的gDNA和cDNA。序列分析结果显示，3个水稻材料中，同属籼稻品种的IR24与JG30，其ZR1同源基因gDNA、CDS及其编码的蛋白质序列完全相同，长度分别为4511 bp、3243 bp和1080 aa，而粳稻品种日本晴ZR1同源基因相应序列长度分别为4480 bp、3243 bp和1080 aa，与籼稻品种的相似性分别为97.8 %、98.5 %和99.1 %；30个鄱阳湖野生菰群落ZR1基因存在2种类型，gDNA、CDS、蛋白质序列分别为4944 bp、3243 bp、1080 aa和4938 bp、3237 bp、1078 aa，差别在于前者第二个外显子插入了6个核苷酸残基，因而编码蛋白相应位置增加了2个氨基酸。利用环鄱阳湖野生菰80份材料，筛选出扩增多态性丰富、带型稳定的20对SSR标记引物和14条ISSR标记引物，2类分子标记的PCR实验数据统计分析结果显示，鄱阳湖流域菰野生种群间存在较大变异，遗传多样性水平较高。首次将ISSR标记技术引入菰的遗传分析，并建立了稳定优化的菰ISSR-PCR反应体系，为国家自然基金项目“基于SSR和ISSR标记的中国菰野生种质资源遗传多样性和遗传结构研究”的顺利实施奠定了基础。