OsWRKY4转录因子在水稻对纹枯病阶段抗性中的调节作用及其分子机理研究

WRKY转录因子调节植物抗病反应和某些发育过程。抑制性差减杂交文库构建、序列表达标签测序分析和Northern杂交等前期工作提示，水稻WRKY4（OsWRKY4）基因可能参与了水稻对纹枯病的阶段抗性。本项目研究OsWRKY4在水稻对纹枯病阶段抗性中的调节功能与分子机理。分析基因的器官（组织）与发育阶段特异性表达以及诱导表达模式；研究蛋白与DNA元件的结合特性、核定位及转录激活（或抑制）活性，以明确其结构与生化功能的关系；创建超表达和RNAi抑制表达的转基因突变体，分析突变体的抗病性和发育表型，以明确其生物学功能。重点分析防卫相关基因、抗病信号途径中的标志基因以及衰老相关基因在转基因突变体中的表达变化，鉴定OsWRKY4的互作蛋白，以明确其调节植物抗病反应和发育过程的分子机理，对深入阐明植物抗病和发育信号途径间的交互作用有重要意义，同时可能作为候选基因应用于作物的分子抗病育种工程。

WRKY转录因子最重要的功能是作为正负调控因子参与抗病信号传递。前期发现OsWRKY4可能参与水稻对纹枯病的阶段抗性。本项目分析了OsWRKY4发育阶段和器官特异表达模式以及诱导表达模式；研究了OsWRKY4的生化特性与结构间的关系；构建了OsWRKY4超表达和RNAi突变株，并分析了其抗性表现；分析了转基因植株中重要抗病相关基因的表达变化，提出了OsWRKY4介导水稻对纹枯病阶段抗性的分子调控机制。.1. 获得了OsWRKY4 cDNA全长序列。长1048bp，包含一个ORF（1320bp），编码一个439aa的蛋白，分子量46.4kD，pI6.5。含两个WRKY结构域，各含一个CCHH锌指，属于WRKY第I组。.2、OsWRKY4在叶中表达最高，茎中次之，根和花中有微弱表达，在种子中几乎不表达。受JA、ET、稻瘟病菌和纹枯病菌强烈而瞬间诱导，而对SA不敏感。.3、OsWRKY4定位于细胞核，具有转录激活特性，其转录激活域位于两个WRKY结构域间的区域（aa262-333）。.4、获得了16个超表达、11个RNAiT2代株系。超表达植株对纹枯病抗性增强，RNAi植株的抗性减弱，表明OsWRKY4是水稻对纹枯病抗性的正调节子。.5、在R. solani 侵染下，OsWRKY4超表达植株中PR1a、PR1b、PR5和PR10/PBZ1表达显著增强，而RNAi植株中其表达显著下降。PR3、LOX、AOS2、PAL/ZB8和CHS的表达未见明显变化。在MeJA和ET处理下，超表达植株中PR1a、 PR1b、 PR5和PR10/PBZ1的表达显著增强，而RNAi植株中表达显著下降。提示OsWRKY4可能通过JA/ET抗病信号途径，调控PR1a、PR1b、PR5和PR10/PBZ1的表达，实现对水稻纹枯病的阶段抗性。.6、OsWRKY4在酵母和烟草细胞中能特异地与PR1b和PR5启动子中的W盒结合；而OsWRKY4不能与PR1a和PR10/PBZ1启动子中的W盒特异结合。说明OsWRKY4直接调控PR1b和PR5，间接调控PR1a和PR10/PBZ1。.上述发现提示，OsWRKY4通过JA/ET信号途径调节水稻纹枯病菌的阶段抗性，对深入阐明WRKY转录因子介导植物抗病与发育信号途径的交互作用具有重要意义，也可作为候选基因应用作物抗病育种。