LINC00900作为ceRNA靶向miR-34a-5p-SIRT1在肠缺血再灌注损伤中的作用及机制

Intestinal ischemia reperfusion (II/R) is a serious clinical dilemma with complex pathogenesis. Massive epithelial apoptosis is critical in the pathogenesis of II/R injury. We previously found that miR-34a-5p-SIRT1 pathway plays important roles in mediating intestinal apoptosis during II/R. Recently, we found that long non-conding RNA LINC00900, who has a conserved binding site targeting miR-34a-5p, is significantly down-regulated in the intestine after I/R. We infer that II/R-induced miR-34a-5p up-regulation may be correlated with LINC00900 down-regulation. Thus, we hypothesis that a LINC00900-regulated miR-34a-5p-SIRT1 axis may play an important role in regulating apoptosis, thus affecting intestinal I/R. In this study, a variety of molecular biology experiments will be carried out in vivo and in vitro for exploring the significant role of LINC00900-regulated miR-34a-5p-SIRT1 axis in the pathogenesis of II/R. This work aims to provide a novel therapeutic target for intestinal I/R injury.

肠缺血再灌注（II/R）发病机制复杂，肠黏膜上皮细胞凋亡是导致II/R损伤关键机制。我们既往报道指出，II/R后小肠miR-34a-5p上调进而抑制SIRT1是诱发凋亡重要原因。在新近研究中，我们发现小肠长链非编码RNA-LINC00900在II/R后显著降低，且与miR-34a-5p具有保守性生物学结合序列，推测II/R后小肠miR-34a-5p的上调可能与LINC00900降低有关，两者存在ceRNA关系。据此我们提出假说：LINC00900通过ceRNA活性抑制miR-34a-5p上调，进而抑制SIRT1介导的IECs凋亡减轻II/R损伤。为验证此假说，本研究利用LINC00900基因敲减小鼠II/R模型和体外缺氧复氧模型，采用多种分子生物学技术验证LINC00900作为ceRNA靶向miR-34a-5p-SIRT1轴调控II/R损伤的作用及机制，以期为II/R损伤提供新的防治靶点。

小肠缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）是临床常见病理生理过程，其对全身多器官，如肺、肝、肾脏的影响远远超过对肠道本身的影响，是临床ICU病人发生急性呼吸窘迫综合征和多器官功能障碍综合征的重要使动因素。在既往研究基础上，为继续完善去组蛋白乙酰化酶（SIRT）家族下游蛋白激酶C（PKC）家族的功能研究，我们构建小鼠I/R模型和肠上皮细胞缺氧复氧（H/R）模型，发现PKCζ在I/R和H/R后可显著发生细胞膜转位激活，该过程可能发挥应激性保护作用。特异性激活PKCζ显著减轻了I/R及H/R损伤。此外，本研究还证明PKCζ可在Ser55位点磷酸化TRAF2，TRAF2的磷酸化促进NF-κB的激活及c-Jun的抑制，发挥抗凋亡及抗炎作用，减轻小肠I/R损伤。为研究非编码RNA（ncRNA）在小肠I/R中的作用及缺血后处理的保护机制，我们在小肠I/R模型基础上建立了小肠缺血后处理模型，证实了缺血后处理的保护效应。通过circRNA表达谱高通量筛选芯片，初步鉴定目前在I/R后及缺血后处理时异常表达的circRNA和mRNA，并利用实时定量PCR进一步验证异常表达的circRNA和mRNA表达趋势。此外，本研究利用生物信息学技术对异常表达的mRNA及所涉及的信号通路做出聚类分析，推测出氧化还原信号、应激抵抗信号及细胞交互信号等通路在小肠I/R中发挥重要作用。最后利用生物信息学技术推测缺血后处理的保护作用可能涉及的circRNA及其调控的信号通路及相关miRNA。该部分研究为小肠I/R过程非编码RNA相关表达谱及缺血后处理的保护作用及非编码RNA相关机制做出初步探讨。最后，小肠I/R诱发自噬功能障碍，进而导致肠上皮细胞过度的细胞凋亡和炎症反应，而抑制miR-665-3p可显著改善以上损伤，并可缓解小肠I/R后全身炎症反应，提高动物生存率。通过对ATG4B的基因敲减研究发现，抑制miR-665-3p对I/R的保护作用与调控靶基因ATG4B的表达及自噬活性有关，敲降ATG4B基因后可显著降低其保护作用。以ncRNA调控网络作为切入点研究SIRT相关信号及自噬途径在小肠I/R后的表达监管机制，进一步完善了小肠I/R多器官损伤的发病机制，对进一步临床干预和治疗小肠I/R及多器官损伤具有重要意义。