lncRNA n409266作为ceRNA在急性肺损伤中的作用机制

LncRNAs play a key regulatory role in most physiological and pathological procedure in human. However, the regulatory role of lncRNA in ALI is not elucidate. Our previous results suggested that the level of lncRNA n409266 of Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (HPMEC) increased after LPS treatment. And we constructed the network of ceRNA (n409266–miR-155–VCAM1) through bioinformatics analysis. We found that the interaction of n409266 and miR-155 as well as their regulatory mechanisms in ALI is not clear. Therefore, we hypothesize that n409266 increases the inflammation and permeability of HPMEC in ALI through ceRNA net. Thus, we used LPS to treat HPMEC and C57/BL mice to establish the ALI model in vivo and in vitro. Techniques including siRNA/cDNA transfection, TER, Transwell, RIP and luciferase report system were conducted to explore the mechanisms of n409266 in regulating the inflammation and permeability of ALI, which contributed to a key and new insight for the prevent and treatment of ALI.

lncRNA参与机体多种病理生理过程并发挥关键调控作用。而lncRNA在急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征过程中的作用如何，目前尚未明确。我们前期研究发现：LPS刺激人肺微血管内皮细胞（HPMEC)导致lncRNA n409266表达增高，经生物信息学分析构建ceRNA(n409266-miR-155-VCAM1)网络发现n409266与miR-155有相互作用，但其对LPS诱发ALI的作用及机制未知，故假设：n409266通过ceRNA机制介导ALI中肺微血管内皮炎性损伤及通透性改变。拟采用LPS处理HPMEC和小鼠的急性肺损伤模型及n409266基因敲除小鼠、miR-155基因敲除小鼠，通过基因转染、TER、Transwell、RIP和荧光素酶报告系统等实验技术，从ceRNA角度探讨ALI中肺微血管炎性损伤及通透性改变机制，为基因水平早期防治ALI提供理论和临床新靶点。

ALI/ARDS的机制十分复杂，确切机制尚不明确，肺微血管内皮细胞损伤被认为是ALI/ARDS发生发展的中心环节之一。因此维持肺微血管内皮细胞的形态和屏障功能的稳定，是治疗ALI/ARDS的重要措施之一。本课题组前期通过LPS刺激人肺微血管内皮细胞（HPMECs）建立ARDS细胞模型，通过高通量芯片和生物信息学分析，发现lncRNA n409266（PLSCR4）表达量显著增高且处于差异表达网络的关键节点上。PLSCR4属于PLSCRs家族，是一组单次跨膜蛋白，呈Ca2+依赖性的跨膜转运细胞膜磷脂（PS）如磷脂酰丝氨酸，从而增加PS的暴露数量。PS在细胞膜外侧的暴露增加，被认为是细胞凋亡和焦亡的特征性病理生理变化。本研究将 HPMECs和小鼠作为研究对象，通过LPS刺激和siRNA干扰等方式构建脓毒症ARDS模型，采用免疫蛋白印迹、酶联免疫吸附实验、荧光实验以及DNA- pull down和质谱检测等实验方法研究 PLSCR在HPMECS损伤中的作用机制，并明确其上游调节因子，为ARDS的临床和基础研究提供新的靶点。.本课题组采用高通量芯片和生物信息学分析方法，构建了基于72个差异表达lncRNAs和132个差异表达mRNAs的共表达网络。网络中差异基因主要与以下通路相关：TNF信号通路、NF-κB信号通路、CAMs、细胞因子-细胞因子受体相互作用和ECM-受体相互作用。其中PLSCR4表达量显著增高并处于表达网络的关键节点上。功能实验研究发现沉默PLSCR4后，HPMECs炎症损伤加重、通透性增加，因此我们推断PLSCR4在HPMECs炎症过程和通透性改变中发挥重要保护作用。进一步研究发现，PLSCR4通过减少GSDMD-NT在细胞膜上的分布，保持细胞焦亡时膜的完整性而发挥保护作用。然后通过建立小鼠肺部感染模型，测量肺组织的W/D，肺损伤评分和HE染色，证实PLSCR4在动物模型中发挥了与细胞实验一致的保护性作用。最后通过DNA-pull down和蛋白质谱鉴定等实验证实P62280转录调控PLSCR4的表达。.本课题研究发现，LPS诱导的HPMECs损伤中，PLSCR4通过降低炎症因子的分泌和稳定单层内皮细胞通透性发挥保护性作用，而P62280可以作为上游的转录因子对PLSCR4的表达起到调控作用。本研究可为ARDS的临床治疗提供新的思路和靶点。