单个尿脱落肿瘤细胞微流控检测辅助术前NMIBC/MIBC鉴别研究

There are significant differences in surgical options of non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) and muscle invasive bladder cancer (MIBC). The accurate preoperative differentiation of NMIBC/MIBC is of crucial importance for the surgical decision and prognosis evaluation, but currently imaging as the key approach for preoperative diagnosis has certain defects. The tumorigenesis of NMIBC and MIBC belongs to two distinct molecular mechanisms. NMIBC is typically characterized by gain-of-function mutations of the FGFR3 gene, accompanied by activation of PI3K/Akt pathways, while MIBC is dominated by loss-of-function mutations of TP53 gene, accompanied by inhibition of p53/RB pathways. Our previous research showed that detection of urinary exfoliated tumor cell (UETC) via microfluidic approach displayed competitive diagnostic performance for bladder cancer, and the UETC quantity was closely correlated with clinicopathological features. In addition, single cell low-depth whole genome sequencing of the enriched UETC revealed obvious copy number variations and tumor heterogeneity. This proposal plans to move a step further based on the previous studies, screening out high-risk UETC subgroup, and focusing on the distinct gene loci of NMIBC/MIBC. Finally, a novel approach for preoperative identification of NMIBC/MIBC will be established by parallel characterization of the quantity and single cell molecular feature of UETC.

非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）的手术方案差异显著。术前准确鉴别NMIBC/MIBC对手术方案选择和预后评估至关重要，但目前以影像学为核心的术前诊断仍有不足。NMIBC和MIBC的发生发展源于两条不同的分子机制。NMIBC以FGFR3基因的功能获得性突变为特征，伴随PI3K/Akt通路的激活；MIBC则以TP53基因的功能缺失性突变为主导，伴随p53/RB通路的抑制。申请人前期研究表明，尿脱落肿瘤细胞（UETC）微流控检测技术具有优良的膀胱癌诊断效能，UETC数量与临床病理显著相关。针对UETC的单细胞低深度全基因组测序也揭示了明显的拷贝数变异特征和肿瘤异质性。本项目拟在前期工作基础上进一步延伸，在UETC中筛选出高危UETC亚群，聚焦其中的NMIBC/MIBC差异基因位点。最后，联合UETC数量信息和单细胞分子信息，建立术前鉴别NMIBC/MIBC的新方法。

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，具有高复发和易进展的特点。传统基于影像学的肿瘤浸润性评估方式存在主观差异大、准确率低的缺点。本项目围绕微流控单细胞检测及其在膀胱癌浸润性鉴别中的应用开展研究。研发了一种新型膀胱癌单细胞检测微流控芯片，通过细胞捕获单元的尺寸与布局优化、微流道的形貌与组合方式优化，提升了微流控芯片的细胞捕获能力及性能稳定性，芯片综合捕获效率>80%，组间变异系数<10%，支撑了膀胱癌单细胞的捕获与检测需求。应用所研发的微流控芯片，联合多抗体组合标记手段，构建了一套微流控循环肿瘤细胞检测方法。基于一组覆盖48例不同临床病理分期的膀胱癌患者队列，建立了循环肿瘤细胞计数与包括膀胱癌浸润性等在内的临床指征之间的相关性。研究发现，MIBC患者相比起NMIBC患者的循环肿瘤细胞计数显著升高[4.67（95％CI，1.41-7.93）vs. 1.88（95％CI，0.76-3.00）CTCs / 3mL; P=0.019]，方法学的综合准确率为0.707（95％CI，0.545-0.869；P=0.023），为NMIBC/MIBC的鉴别诊断提供了全新思路。此外，循环肿瘤细胞计数与膀胱癌病理分级也密切相关，有望成为辅助膀胱癌风险评估的新型生物标志物。在此基础上，针对膀胱癌尿脱落肿瘤细胞及其配对肿瘤组织开展全外显子组测序研究，结果显示两者中均携带系列膀胱癌高频突变，且存在明显的异质性特征。经突变区域比对，提示了两者的基因起源同源性，为理解膀胱癌的体细胞突变情况提供了参考。本项目进一步开展了膀胱癌代谢研究，利用非靶向代谢组学方法揭示了NMIBC和MIBC中存在的显著代谢特征差异，并挖掘出31种差异代谢物可作为提示膀胱癌浸润性的潜在分子标志物。此外，基于单细胞质谱分析技术在单细胞水平实现了耐药性膀胱癌细胞的检测分析，为探索肿瘤浸润性与耐药性的关联奠定了基础。