基于神经调控的载药骨修复材料的仿生构建及成骨机制研究

Reconstructing the functional bone in vitro by imitating the composition, structure and function of natural bone tissue, has been one of the hotspot and difficulties in the research of bone tissue engineering. Inspired by the characteristics of the secretion of nerve growth factor and neural regulation function in the process of natural bone regeneration, this project proposes a new idea to reconstruct drug loaded bone repairing material with nerve regulation function through integrating traditional Chinese medicine and neural factors into bone regeneration. This project plans to choose ophiopogon steroidal saponin with similar neurotrophic role to nerve growth factor as drug model, construct drug-loaded microspheres utilizing collagen as the sustained release carrier, and fabricate drug-loaded bone repair materials using the drug-loaded microspheres, nano-biogalss, and phosphoserine. This project aims is to realize the controlled release of the drugs and explore the dynamic law by discussing the structure of the scaffold and the distribution of the drugs in the materials. The research is focus on following topics: in vitro effect of drug-loaded bone repair materials on neurite elongation and proliferation, mineralization, nerve growth factor expression of osteoblast; in vivo effect of bone defect repair arises from drug-loaded bone repair material. As a result, the project aims to discover the inducing effect of the repair materials on the growth of nerve fibers and bone formation, and reveal the action mechanism. The understandings obtained from this project are expected to explore a new strategy for the development and clinical application of neurotized bone repair materials and provide theoretical and practical basis.

模仿天然骨的组成、结构及功能，体外仿生重建功能化骨是骨组织工程研究的热点及难点。本项目受骨再生过程中神经生长因子分泌和神经支配特点启发，提出将神经因素和传统中药融入骨修复重建的新思路。拟从具有神经支配功能的骨修复材料的构建出发，选用具有拟神经生长因子活性的药物-麦冬的有效成分甾体皂苷，以胶原为缓释载体构建载药微球；再将其与纳米生物活性玻璃、磷酸丝氨酸、胶原溶液等复合，仿生构建载药骨修复材料。深入研究材料的孔隙结构和药物在材料中的分布状态对药物释放动力学影响的科学规律，实现对负载药物的时空控制释放。重点于体外研究该材料对神经细胞突起伸长和成骨细胞增殖、矿化、神经生长因子表达的干预作用，于体内研究其修复骨缺损的成骨效能，探索神经支配下骨修复策略，揭示该材料诱导神经纤维生长并促进成骨的生物效应和作用机制。研究成果旨在为神经功能化骨修复材料的研制和临床应用探寻新策略并提供理论和实践依据。

模仿天然骨的组成、结构及功能，体外仿生重建功能化骨是骨组织工程研究的热点及难点。本项目受骨再生过程中神经生长因子分泌和神经支配特点启发，将神经因素和传统中药融入骨修复重建，构建具有神经调控功能的载药骨修复材料。选用具有拟神经生长因子活性的药物-麦冬的有效成分甾体皂苷，以胶原为缓释载体，应用新型双乳化-化学交联技术构建载药微球；再采用纳米合成和冷冻干燥技术，将其与纳米生物活性玻璃粉体、磷酸丝氨酸、胶原溶液等复合，构建双侧致密程度不一致、载药微球在材料内由中间向两侧呈梯度分布的多层骨支架材料。研究发现：在水相与油相的质量比为1:5，药物与胶原的质量比为1:2，乳化时间为40分钟的最佳实验条件下，可制备出颗粒分布均匀、粒径约8μm、表面形态规则、按Higuchi模型长效缓释的载药胶原微球；对载药支架材料的微观形貌观察发现，支架双侧致密程度不同、层间无明显分界线，孔径在50～200μm之间，孔隙连续，载药微球定位在基质上；体外释药性能研究发现，支架因其组成和结构呈梯度分布特点可实现对负载药物的时空控制释放。药物沿材料紧密层向疏松层扩散时，释放速率较快；而当药物沿材料疏松层向紧密层扩散时，释放速率较慢。这种定向差异的控缓释作用使其能根据生物组织不同部位的需要量以适宜浓度和速度释放药物；仿生矿化实验表明，载药支架材料可在模拟体液中矿化形成羟基磷灰石晶体。材料中的各组成可协同调控矿物的成核、定向、尺寸以及生长速率；体外细胞实验表明，载药支架材料无溶血现象，有良好的血液相容性。能显著促进MC3T3-E1细胞增殖、提高其分泌ALP和NGF水平，并可诱导PC12神经细胞分化，突起伸长，从圆球形变为双极形；体内动物实验表明，载药支架能实现对骨缺损的修复。至12周时，骨缺损处材料完全降解，髓腔再通，形成具有哈佛氏系统的新生板层骨组织。CGRP免疫阳性感觉神经和NPY免疫阳性自主神经可于新生骨痂中检测到。且载药支架可显著提高新生骨中神经肽CGRP和NPY表达水平，在促进局部成骨方面优势明显；分析成骨机制为：载药支架材料可借助其组成和缓释药物的生物活性，促进骨缺损外周神经元存活，刺激突起伸长，诱导肽能神经长入新生骨组织。再借助新生神经分泌的神经肽类物质调控骨的代谢，促进新骨形成及成熟。本研究为具有神经支配功能的骨修复材料的研制及临床应用提供了实践和理论依据。