探寻调控肺炎链球菌磷壁酸在宿主体内合成的证据

磷壁酸是革兰阳性菌细胞壁的主要组成部分，介导病原菌对宿主的定植，是一种重要的毒力因子。肺炎链球菌在进入宿主后，调控磷壁酸合成量是其适应宿主环境选择压力一种重要策略，但其调控机制尚不清楚。spd1672是我们从肺炎链球菌中筛选出的一个体内诱导基因，动物实验结果提示spd1672基因缺陷后能够显著减弱肺炎链球菌在鼻咽部及肺部定植能力，进一步研究还发现，该基因能够控制磷壁酸的合成。由于spd1672基因本身是一种体内诱导基因，因此spd1672基因是研究体内环境诱导磷壁酸合成的一个良好切入点。本研究拟通过生物信息学、细菌单杂交、EMSA、DnaseⅠ足迹等实验，筛选调控spd1672基因表达的转录因子，观察体内环境对其的调控作用，并通过体外实验寻找调控该转录因子的环境因素。通过本研究可揭示肺炎链球菌磷壁酸在宿主体内诱导合成的调控机制。

磷壁酸是肺炎链球菌的重要成分，参与细菌的多种生理和病理调节，是一种重要的毒力因子，但其生物合成及调控机制尚不清楚。课题组前期发现了一个spd1672（rafX）基因是参与磷壁酸合成的重要基因，本项目即以该基因为基础，筛选鉴定其可能的转录调控蛋白，并通过功能研究分析磷壁酸的调控机制。. 本研究通过生物信息学分析出rafX基因启动子可能的区段，合成了生物素标记的启动子序列207bp的探针，采用DNA pulldown技术筛选出与之可能有结合的蛋白，通过EMSA验证，发现CcpA、磷酸化形式的ComE（ComE-P）、GntR（SPD_0064）、MarR（SPD_0379）、SPD_0410、HU和Tr-act与启动子序列有特异性结合。进一步足迹实验鉴定出comE-P与rafX启动子的特异性结合区域，该序列位于该基因起始密码上游约30bp的地方，序列为：5’-ACAATATAGGATAGCTTACTATTATCTG-3’。我们通过LacZ报告基因检测rafX基因表达、ELISA、Dot blotting和流式细胞术检测细菌磷壁酸的含量变化，结果发现spd_0379（marR）基因缺陷后，细菌的rafX基因表达上调，磷壁酸含量也显著升高，且缺陷菌的自溶较野生菌明显提前，提示蛋白MarR负调控rafX基因的表达，抑制细菌磷壁酸的合成，参与细菌自溶的调控。. 荚膜多糖（CPS）是肺炎链球菌的重要毒力因子，但目前尚不清楚有哪些蛋白可调控其基因的表达。本项目在rafX基因启动子结合蛋白实验技术建立的基础上，对cps基因座启动子序列的结合蛋白进行了筛选，并通过EMSA和DNA足迹实验鉴定了SPD_0410、Tr-act和GntR与cps启动子序列的特异性结合位点。cps基因表达和荚膜多糖含量检测实验证实了GntR对cps基因簇具有负调控作用。. 此外，本研究还探讨了催化三磷酸甘油醛转变为1,3二磷酸甘油酸的GAPDH分泌是否与磷壁酸相关，发现其与DnaJ存在直接结合，提示后者可能参与前者的分泌。而磷壁酸作为TLR2的配体可诱导宿主细胞的天然免疫反应，本研究发现IL-27可上调肺部的成纤维细胞和上皮细胞的TLR4的表达，增强LPS诱导的IL-6和IL-8表达，增强细胞的天然免疫反应。. 通过本项目研究，为磷壁酸和荚膜多糖的合成调控机制及其生物学功能分析提供了有价值的实验证据。