病毒P蛋白磷酸化水平对新城疫基因组转录和复制的调控机制研究

NDV P蛋白是RNP复合体的重要组成原件，一般认为P蛋白通过磷酸化水平的变化调控RNP复合体的功能。尽管如此，由于技术水平的限制，我们对NDV P蛋白的磷酸化位点及其相关生物学特性知之甚少。本实验室在前期工作中通过生物信息学和微型基因组初步筛选到了NDV P蛋白7个功能性的潜在磷酸化位点。7个位点的缺失能够不同程度地抑制或促进报告基因蛋白的表达。我们拟通过放射性标记和质谱分析的方法验证潜在磷酸化位点。同时，利用微型基因组平台和反向遗传平台检测特定P蛋白磷酸化位点对于基因组转录复制调控作用，确定其对病毒生物学活性的影响。通过本课题的研究确定NDV P蛋白具有重要生物学意义的磷酸化位点，并深入分析探讨特定磷酸化位点对病毒RNA装配、RNP复合体的形成中起的作用以及对病毒复制转录的调控。本研究的开展将对我们深入了解病毒的复制和转录机制、研究全新的新城疫病毒防控方法有着重要意义。

新城疫病毒（NDV）的磷蛋白（P）是一种高度磷酸化的病毒蛋白。一般认为，磷蛋白的磷酸化水平对磷蛋白的生物学功能起着至关重要的作用。为了确定NDV P蛋白磷酸化的生物学意义，本研究根据磷酸化位点保守性的理论，利用生物信息学的方法比对了35株新城疫病毒的P基因序列，筛选到了25个NDV P 蛋白的磷酸化位点。通过磷酸化质谱检测NDV病毒粒子中P蛋白的磷酸化残基，我们确定了预测结果的准确性。进而，通过磷酸化抑制剂和激活剂药物的筛选，结果发现PKC蛋白激酶相关的磷酸化位点具有生物学意义，推测其中T44，S48，T111，S125，T271和S373位是重要的磷酸化位点。为了进一步验证这些位点的生物学意义，本研究以NDV微型基因组为平台，利用一系列不同磷酸化位点缺失的P蛋白真核表达质粒作为辅助质粒，根据报告基因表达量的变化、以及RT Real-time PCR检测基因组RNA、反向基因组RNA以及mRNA水平的波动，筛选出其中重要的5个PKC激酶磷酸化位点，其中111位的磷酸化状态对病毒基因组的转录水平抑制作用最显著。.为了研究P基因磷酸化位点在P基因编码蛋白功能中所起的作用，我们首先研究了P/V/W蛋白的功能。结果显示：NDV感染后能够激活RIG-I通路，诱导IFN及其下游基因表达；NDV V蛋白通过介导IFN信号通路中间关键因子STAT1的降解从而阻断IFN信号。从研究数据来看，NDV感染会导致pSTAT1的泛素化降解，进而引起STAT1总量在一定程度上的下调，抑制IFN下游基因的表达； IFN-I刺激是NDV降解STAT1的先决条件 NDV P/V/W 蛋白都具有泛素化降解pSTAT1的作用，其中的V蛋白的C段结构域（CTD）起主要作用。.通过生物信息学分析，确定T111磷酸化位点位于P蛋白N端的结构紊乱区，推测可能是通过影响NP单体结合结构域或PMD的功能从而发挥作用。Co-IP的实验验证，T111位磷酸化位点的缺失不会影响P蛋白之间的互作，即P蛋白的多聚化；而与NP蛋白的结合能力则受到了影响。在T111位残基不能磷酸化的情况下，P蛋白与NP蛋白的结合能力增强。可以推测，T111位点的磷酸化位点影响了P蛋白结构紊乱区的结构。而紊乱区的结构变化造成了P蛋白与NP蛋白结构区域的遮蔽，进而影响了P与NP蛋白的结合能力以及RdRp的运作效率。