反义lncRNA LNC_000710 对新城疫病毒复制的调控机制研究

Long non-coding RNAs (lncRNAs) play an important role in virus infection. Newcastle Disease Virus (NDV) is not only one of the most important pathogens which do a great harm to world poultry industry, but also it is a specific oncolytic virus. So far, the critical lncRNA in NDV infection has not been identified. An antisense lncRNA LNC_000710 was upregulated after NDV infection and it promoted the NDV replication using RNAi. However, the mechanism how the LNC_000710 regulated the NDV replication remains unclear. Therfore, this project will conduct the following studies.(1) The role of LNC_000710 in virus replication will be validated using overexpression; (2) The mechanism of lncRNA in virus replication will be investigated using RNA Pulldown and RIP; (3) The innate immune response pathways will be investigated after knockout of LNC_000710 via CRISPR-Cas9 and the role of LNC_000710 in innate immune response will be analyzed. This project will enhance the knowledge of NDV-host interaction and benefit to discovery of new antiviral target. In addition, this project also offers insight into the roles of lncRNAs in innate immunity after infection of other viruses.

lncRNA在宿主细胞抵御病毒感染时发挥重要的作用。NDV既是危害全球养禽业的重要病原之一，也是一种特异性的溶瘤病毒。迄今为止，与NDV感染有关的lncRNA还没有被发现。我们前期研究发现反义lncRNA LNC_000710在感染NDV后显著上调，并且敲低LNC_000710的表达后促进病毒复制，但其对NDV复制的调控机制还不清楚。因此本研究将（1）对LNC_000710过表达后，进一步验证LNC_000710对NDV复制的作用；（2）利用RNA Pulldown和RIP等技术揭示LNC_000710对NDV复制的调控机制；（3）以CRISPR-Cas9等手段对LNC_000710阻断后，分析天然免疫应答通路和通路中相关基因的表达。研究结果对揭示lncRNA对NDV复制的调控机制具有重要意义，增进对NDV与宿主细胞互作的认识，有利于发现新的抗病毒靶点，丰富和发展对lncRNA的认识。

lncRNA在宿主细胞抵御病毒感染时发挥重要的作用。NDV既是危害全球养禽业的重要病原之一，也是一种特异性的溶瘤病毒。迄今为止，与NDV感染有关的lncRNA还没有被发现。我们前期研究发现反义lncRNA lnc_000710在感染NDV后显著上调，并且敲低lnc_000710的表达后促进病毒复制，说明lnc_000710对病毒复制有抑制作用。本研究对lnc_000710对NDV复制的调控机制做了进一步的探索。 .通过对lnc_000710的分析，明确了lnc_000710基本分子生物学信息和与病毒复制的关系。获得了lnc_000710的全长和转录本大小；获得了lnc_000710在病毒感染不同剂量、感染不同时间、感染不同病毒、感染不同细胞系后的表达谱。原位杂交结果显示lnc_000710在病毒感染前和病毒感染后都定位在细胞核。结合lncRNA分子的细胞定位，分离鉴定了与lnc_000710相互作用的蛋白ILF2，过表达与敲低ILF2后发现ILF2也可以抑制病毒复制。通过核质分离和免疫荧光分析了ILF2的细胞定位。在病毒感染前ILF2主要定位在细胞核，病毒感染后ILF2主要定位在细胞质。由于ILF2是重要的细胞核因子，对ILF2的Chip-seq结果显示ILF2可能通过调控NF-kB的转录调控下游炎症因子和天然免疫反应抑制病毒复制。对lnc_000710的敲低后感染病毒，RNA-seq结果显示NF-kB的表达上调。综上所述，lncRNA lnc_000710与ILF2结合通过调控NF-kB的表达调控下游炎症因子和天然免疫反应影响病毒复制。.目前发现的长链非编码RNA主要集中在人和鼠上，在其它物种上几乎没有报道lncRNA和它的功能，因此该项工作的科学意义在于发现一条新的鸡的长链非编码RNA lnc_000710，并且发现这条lncRNA有可能通过调控NF-kB的表达影响病毒复制和天然免疫反应。