Survivin通过Ikkβ 调控食管鳞癌细胞自噬晚期过程的分子机制的研究

Macroautophagy is a degradation mechanism that delivers cytoplasmic materials to lysosomes via double-membraned organelles named autophagosomes in cells. The previous data shown that the initiation stage of macroautophagy were regulated by Beclin-1/Survivin and IKKβ/AMPK-mTORC1 signals separately. But, whether autophagosome maturation and degradation in late stage of macroautophagy was.regulated by Survivin-IKKβ is still remain unknown. Our pre-experemental data indicated that Survivin might increase the activaties of NFkB through up-regulating IKKβ on the transcription level in tumor cells. Macroautophagy process will be blocked at the stage of autophagosome maturation and degradation in the absence of Survivin and Ikk beta. These interferences also changed the mRNA levels of Lamp1and RAB7. The methods of A transmission electron microscope, Fluorescent Inverted Microscope, qPCR and Western blot will be used to visualize autophagysomes, to provide more evidence that Survivin-IKKβ functions as an autophagosome maturation and degradation regulator via Lamp1 and RAB7 on transcription level. It is tempting to speculate that the novel signal transduct mechanism may activate different biology processes in the late stage of autophagy.

细胞自噬是一个通过双层膜的自噬体将胞浆内物质转送到溶酶体降解的机制。资料显示Survivin可以通过干预Beclin-1及IKKβ通过AMPK/mTORC1各自独立调控细胞自噬的起始过程。但是，Survivin是否通过正向调控IKKβ实现对细胞自噬溶酶体形成阶段的调控机制尚不清楚。我们的前期研究结果显示，在肿瘤细胞中，Survivin可以正向调控IKKβ的表达激活NFkB；Survivin与IKKβ的缺乏使细胞自噬过程停顿在自噬溶酶体形成之前；Survivin与IKKβ对自噬溶酶体形成的调控信息系统中Lamp1、RAB7基因具有调控作用。因此，本项目拟采用透射电镜、荧光倒置显微镜和蛋白检测等方法观察Survivin和IKKβ对肿瘤细胞自噬及凋亡的影响, 确定Survivin-IKKβ对肿瘤细胞自噬溶酶体形成相关基因的新的调控及其分子机制, 为后续更详尽的分子机制研究提供实验基础。

细胞自噬是一个通过双层膜的自噬体将胞浆内物质转送到溶酶体降解的机制。资料显示Survivin可以通过干预Beclin-1及IKKβ通过AMPK/mTORC1各自独立调控细胞自噬的起始过程。但是，Survivin是否通过正向调控 IKKβ 实现对细胞自噬溶酶体形成阶段的调控机制尚不清楚。本项目采用透射电镜、荧光倒置显微镜和蛋白检测等方法观察Survivin和IKKβ对肿瘤细胞自噬及凋亡的影响; 确定Survivin-IKKβ对肿瘤细胞自噬溶酶体形成相关基因的新的调控及其分子机制; 为后续更详尽的分子机制研究提供实验基础。研究结果显示：1）通过RAPA诱导转染了mRFP-eGFP-LC3质粒的Eca-109细胞后，激光共聚焦显微镜可观察该细胞中绿色荧光明显增多（P＜0.05），即自噬体增多；Western blot检测结果显示，LC-I、LC-II的蛋白表达量呈现升高的趋势，LC-I/LC-II的比值减少，p62表达量下降，自噬增强；2）在Eca-109细胞自噬模型中，SVV过表达后，Rab7、LC3蛋白表达量增加（P＜0.05），ATG5蛋白表达量下降、ATG16L1蛋白表达量变化不明显。当SVVshRNA及YM155干预后，Rab7蛋白表达量增加，ATG5、ATG16L1（P＜0.05）蛋白表达量下降，p62表达量下降；3）SVV过表达后细胞中Cathepsin-D胞浆外逸，分布呈弥散状。综上，本项目选用雷帕霉素对细胞进行诱导构建了自噬模型；RAPA诱导Rab7、ATG5、ATG16L1表达增高，而ATG5、ATG16L1表达增高依赖于SVV的存在；SVV与RAPA诱导的肿瘤细胞自噬过程是一种特定时段和明确的靶基因的伴随调控关系，它参与了自噬过程的前期自噬体形成及后期自噬溶酶体功能实施阶段。ATG5/ATG16L1和p62是SVV在自噬形成过程中的调控位点，在自噬体形成初期，SVV通过控制ATG5/ATG16L1基因的表达促进早期自噬体的形成，促进自噬体的起始过程，同时抑制了自噬体的降解；SVV在肿瘤中特异性的高表达会干预溶酶体的功能，主要表现在影响溶酶体酸性环境和溶酶体膜通透性两个方面。