CCN3对肾小球系膜细胞胞外基质的影响及microRNA-29在其中的作用机制探讨

Synthesis and deposition of extracellular matrix (ECM) of mesangial cells is the main cause of glomerulosclerosis. And it was important to study the regulation mechanism of ECM for prevention and treatment of glomerulosclerosis. Our previous study found that CCN3 was a key anti-fibrosis factor and it could ameliorate glomerulosclerosis, but the mechanisms underlying this process are incompletely understood. We also found the expression of CCN3 and microRNA-29 in the urine of CKD patients were both decreased, and both of them were negatively correlated to the degree of renal fibrosis. microRNA-29 is a downstream inhibitor of TGF-β/Smad3, which could inhibit the expression of ECM and prevented glomerulosclerosis. Our hypothesis is CCN3 could inhibit the ECM synthesis and/or enhancement the ECM degradation through regulating expression of microRNA-29, thereby prevent glomerulosclerosis. We plan to investigate the effect of CCN3 on the ECM and microRNA-29, and study the effect of microRNA-29 on the ECM by transfected microRNA-29 inhibitor/mimics. The results of this study will clarity the effect of CCN3 on the glomerulosclerosis and the underlie mechanism.

系膜细胞胞外基质（ECM）集聚是肾小球硬化形成的主要原因，探讨ECM调控机制对肾小球硬化防治具有重要的意义。我们前期研究发现，CCN3是重要的纤维化抑制因子，它可减轻肾小球硬化形成，但详细机制仍有待阐明。我们还观察到CKD患者尿液中CCN3和microRNA-29表达均下降，且均与肾脏纤维化程度呈负相关。而microRNA-29作为TGF-β1/Smad3通路的下游调节因子，可减少ECM的产生，抑制肾小球硬化。为此我们提出假说：CCN3通过调节microRNA-29的表达，抑制系膜细胞ECM的产生和/或促进ECM的降解，从而抑制肾小球硬化的形成。我们拟研究CCN3对系膜细胞ECM的影响及microRNA-29的表达变化；并转染microRNA-29的抑制物和类似物，评估microRNA-29在CCN3调节ECM中的作用，从而阐明CCN3对肾小球硬化的影响及作用机制。

目的：肾小球硬化是慢性肾脏病进展的重要机制，其特征是肾小球系膜细胞增生、细胞外基质大量沉积。本实验旨在探讨CCN3对肾小球系膜细胞胞外基质沉积的影响。方法：1、体外培养人肾小球系膜细胞（HMC），观察不同浓度不同时间转化生长因子β1（TGF-β1）作用HMC 24h，CCN3蛋白表达情况。2、TGF-β1和外源性给予不同浓度CCN3干预HMC或建立高表达CCN3质粒瞬时转染HMC，Real Time-PCR技术检测各组FN、COLI、MMP-2、MMP-9、TIMP-1 、micro-RNA29mRNA表达情况，Western blot、激光共聚微镜焦显微镜技术检测各组FN、COLI、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表达水平。结果：⑴ TGF-β1可抑制HMC CCN3 蛋白的表达，呈浓度和时间依赖性（P < 0.05）。⑵TGF-β1组细胞FN及COLI蛋白及mRNA表达明显增加（P < 0.05），CCN3时即可显著抑制TGF-β1诱导COLI及FN的表达，抑制效应呈浓度依赖性；⑶ TGF-β1组MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA水平显著降低（P < 0.05），TIMP-1蛋白及mRNA水平显著升高（P < 0.05），CCN3重组蛋白干预后，MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达均较TGF-β1干预组显著上调而TIMP-1蛋白及mRNA表达较TGF-β1干预组显著下调（P < 0.05）。⑷ 与TGF-β1组相比，内源性转染pcDNA-3.1（+）-CCN3质粒FN、COL1及TIMP-1蛋白及mRNA的表达均显著降低，MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达显著升高（P < 0.05、P < 0.01）。外源性及内源性CCN3可诱导TGF-β1干预的HMC micro-RNA29 mRNA的表达（P < 0.05）。转染miScript MicroRNA-29 Mimics，可协同CCN3抑制HMC FN及COL1生成的作用，转染miScript MicroRNA-29 Inhibitor，能拮抗CCN3抑制HMC FN及COL1生成的作用（P < 0.05）。结论： CCN3通过micro-RNA29抑制TGF-β1诱导的HMC胞外基质的生成及促进HMC胞外基质降解抑制胞外基质的沉积，在肾小球硬化的防治中具有潜在的应用价值。