一种弓形虫脂筏内蛋白功能及其介导的信号通路研究

为了阐明弓形虫体内14-3-3蛋白的功能，尤其是在信号转导方面的作用，我们利用酵母双杂交、染色质免疫沉淀技术检测弓形虫RH株速殖子内与14-3-3相互作用的蛋白，以及14-3-3蛋白与弓形虫基因组DNA作用的情况。然后利用RNA干扰技术构建弓形虫14-3-3沉默表达体系，同时也建立14-3-3蛋白的超表达体系，来分析抑制和超表达14-3-3以后蛋白质及相关细胞分子的差异表达，对此进行差异蛋白质组学研究。同时还分析对速殖子入侵能力和增殖能力的影响。根据相关蛋白表达的差异我们确定14-3-3在信号通路中的位置，并且确定它的上下游信号分子。并根据这一思路逐一分析与14-3-3相关的蛋白，探索各信号分子的作用及所处位置。以此初步建立14-3-3介导的信号通路和与其他信号途径的衔接。

刚地弓形虫是一种呈世界性分布的重要机会性致病原虫，专性寄生细胞内，人与动物均能感染，引起人兽共患弓形虫病。在真核细胞内信号传导通路研究中，发现了一组关键信号蛋白14-3-3蛋白家族。14-3-3蛋白是广泛存在于植物、酵母、原虫、蠕虫、昆虫和包括人在内的多种动物真核细胞内的一种高度保守蛋白。在本研究中，3D结构分析显示14-3-3蛋白主要以同源或异源二聚体存在，形成一个U型结构。通过RT-PCR扩增出其基因片段并成功构建真核表达质粒。荧光显微镜下观察到重组质粒能够在HEK293细胞中表达。Western-blot分析结果显示，在转染pEGFP/14-3-3重组质粒的细胞中，存在表达的弓形虫14-3-3蛋白，相对分子质量约为30kD。我们从生物信息学角度分析了14-3-3蛋白在信号转导中的作用，研究了与之相关联的组织蛋白酶的功能，并验证了此蛋白在双基因疫苗中的积极作用。以上研究为今后从基因水平和蛋白水平进行疫苗研究和诊断试剂开发奠定了基础。