应用基因敲除小鼠探讨miRNA调控血脑屏障的机制研究

MiRNA在许多生命活动中发挥重要作用，然而是否有miRNA参与血脑屏障的功能调节，目前尚未报道。本课题试图探讨miRNA在血脑屏障中的作用和机制。我们前期研究发现，miR-126是血管内皮特异表达的miRNA，其基因敲除小鼠在胚胎期和成年后都表现出明显的器官出血表形，表明miR-126参与血管完整性的调节。考虑到血管完整性对于血脑屏障具有重要意义，我们推测miR-126可能参与了血脑屏障的形成和功能调节。通过分析，我们认为miR-126可能通过3种方式影响血脑屏障：1.miR-126影响内皮细胞间的紧密连接。2.miR-126调节内皮细胞的基因表达，改变内皮细胞对外周细胞的募集作用。3.miR-126影响脑血管基底膜的形成。本课题将在miR-126基因敲除小鼠的基础上应用指示剂示踪、透射电镜等方法验证上述3种可能性，并探讨miR-126作用的分子机制，从而为神经疾病的防治提供理论基础。

血脑屏障是由内皮细胞组成的具有选择通透性的屏障系统。MiR-126能调节血管完整性，本研究探讨miR-126在血脑屏障中的作用。我们通过观察伊文氏蓝或Dil染料经静脉注射后能否透过血脑屏障，来确定miR-126的作用，结果显示染料都不能透过miR-126 KO小鼠的血脑屏障；电镜观察显示miR-126 KO小鼠血脑屏障的基底膜未受影响，表明miR-126 KO不影响血脑屏障的生理功能。在研究中，我们发现miR-126位于EGFL7内含子，EGFL7/miR-126双突变小鼠头部的出血程度比EGFL7突变和miR-126 KO小鼠严重，表明EGFL7和miR-126协同调节血管完整性，因此我们调整方案来研究EGFL7/miR-126双突变对血脑屏障的影响，结果显示伊文氏蓝或Dil染料不能透过EGFL7/miR-126双突变小鼠的血脑屏障。然而我们发现EGFL7/miR-126双突变小鼠的血管数量减少，提示EGFL7和miR-126参与血管新生；同时我们发现miR-126敲除的内皮细胞肿胀，表明内皮功能受损。因此我们调整方案来研究EGFL7/miR-126在血管新生和损伤修复这两方面的作用。我们发现：1、EGFL7突变导致血管数量减少，miR-126 KO、EGFL7/miR-126双突变导致头部血管网格状排列；进一步观察miR-126、EGFL7在肿瘤血管新生中的作用，显示EGFL7突变、miR-126 KO或EGFL7/miR-126双突变都能通过影响血管新生抑制肿瘤生长；通过侧枝循环模型研究发现，EGFL7突变和EGFL7/miR-126双突变小鼠后肢的血流减少；经过10天修复，EGFL7突变小鼠和EGFL7/miR-126双突变小鼠的后肢缺血程度未见减轻。2、在动脉粥样硬化模型中，miR-126 KO小鼠血管更容易形成脂质斑块；在肺血管重塑模型中， miR-126 KO促进野百合碱诱发的肺血管重塑和肺微小血栓形成，进而导致右心肥厚；在脑缺血损伤模型中， miR-126 KO小鼠在结扎后死亡时间明显早于对照组。在EGFL7/miR-126作用的分子机制方面，我们发现miR-126，能够抑制ADAM9，PTPN9，THAP6，E2F7，SPRED1，VCAM1，RGS3，IL10RA等多个基因的表达，进而调控VEGF/MAPK信号通路。