鉴定dystrophin基因外显子中的剪接调控序列及其在治疗Duchenne型肌营养不良症中的应用研究

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is usually caused by frame-shift mutations in the dystrophin gene.Using antisense oligonucleotides (AONs) target exonic splicing regulatory sequences (ESRS) to modify splicing is known to be the most promising therapy for DMD patients. Therefore, identifing the ESRS and understanding its regulatory function in the dystrophin gene would be benefit for antisen-based therapy. In our preliminary study, we identified a nonsense mutation that induce almost completely exon25 skipping. We hypothesize that the mutation may disrupt an ESRS. In this project, we will explore the mechanism of exon skipping induced by this nonsense mutation and identify the ESRS responsible for exon 25 skipping. In addition, we will design AONs to target the ESRS and test its therapeutic effect using DMD patient derived muscle cells. Our study will help understanding the splicing mechanisms and developing strategies by modulating splicing to treat numerous diseases.

Dystrophin基因发生移码突变通常导致儿科最常见的遗传性致死性肌病-Duchenne型肌营养不良（DMD）。目前该病尚无有效治疗方法。近期研究表明用反义寡核苷酸（AONs）靶向外显子中的剪接调控序列，诱导外显子跳读是一种最有前景的治疗方法。因此，鉴定dystrophin基因外显子中的剪接调控序列，探讨外显子识别和剪接调控机制对DMD的治疗至关重要。本课题前期研究发现dystrophin基因无义突变c.3340A>T可以诱导第25号外显子跳读，据此我们推测该突变部位涉及外显子中的剪接调控序列。本项目将以此为模型，深入研究外显子识别和剪接调控机理。与此同时，我们将通过鉴定第25号外显子中的剪接调控序列，为AONs 疗法提供靶向位点, 并探讨其在DMD的治疗中的应用。本研究有助于深入理解剪接调控机制，并为推动干预剪接治疗疾病的新策略提供理论基础和依据。

利用反义寡核苷酸(AONs)或其他小分子化合物干预外显子剪接是治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)最有临床应用前景的方法，其中诱导dystrophin基因第51号外显子跳读的反义药物Eteplirsen近期已由FDA批准上市。对于该基因任何外显子剪接调控机制的了解均有利于小分子药物的开发和剪接干预疗法的临床推进。基因编码区内剪接调控序列发生突变可以导致很多种疾病的发生，但同时也提供了一个深入研究剪接机制的有力模型。我们在前期突变筛查中发现无义突变c.3340A>T诱导dystrophin基因第25号外显子跳读，并初步鉴定出突变处涉及的剪接调控序列。本课题在前期工作的基础上，主要完成: (1)对第25号外显子内的正向和负向剪接调控元件及与其结合的剪接调控蛋白的精确鉴定。 (2)明确这些调控元件和相应结合蛋白对剪接体识别5’ 和3’ 剪接位点的影响, 阐明c.3340A>T诱导外显子跳读的机理, 并揭示了正常第25号外显子剪接调控的分子机制。(3)以正向剪接调控序列为靶点，在体外培养的成肌细胞中筛选出有效诱导第25号外显子跳读的AON。本课题通过研究外显子中单个碱基置换是如何影响剪接来阐明外显子识别的调控机理，我们的结果为小分子药物干预剪接治疗DMD提供必要的理论基础和依据。此外, 本课题在突变筛查中发现外显子部分缺失导致多重PCR 和MLPA差异性结果的病例以及重复突变激活cryptic exon的病例，为DMD的分子诊断提供指导。