硫化氢对大鼠肝脏缺血再灌注损伤中内质网应激相关分子表达及凋亡调控机制的研究

Our initial studies suggested the involvement process of Hydrogen sulfide system in liver ischemia-reperfusion injury, and found exogenous Hydrogen sulfide played a protective role in this process by reducing hepatocyte damage and suppressing their apoptosis, but its functional mechanism is unknown. Recent researches has proved the important role of Hydrogen sulfide in endoplasmic reticulum stress process because Hydrogen sulfide took part in corresponding signal transduction pathway and intracellular calcium homeostasis and apoptosis and others. This paper proposed the scientific hypothesis that endoplasmic reticulum stress and the molecular involved consequent apoptosis come into play a protective role for cell in liver ischemia-reperfusion injury by the action of Hydrogen sulfide. With the objective to explore the effects of Hydrogen sulfide on liver ischemia-reperfusion injury of rats, based on form of organizations and molecular biology and other technologies, and through the observation the expression changes in key molecule of signal transduction pathway of involved protein in endoplasmic reticulum stress process and mediated apoptosis in liver ischemia-reperfusion injury of rats with Hydrogen sulfide, this project explained the regulation mechanism of Hydrogen sulfide in endoplasmic reticulum stress and induced apoptosis in liver ischemia-reperfusion injury to provide potential theoretical basis for Hydrogen sulfide as a medicine protect cells in liver ischemia-reperfusion injury process.

我们前期研究提示硫化氢系统参与肝脏缺血再灌注损伤的过程，并在肝脏缺血再灌注损伤中外源性硫化氢通过减轻肝细胞损伤、抑制凋亡，从而在肝脏缺血再灌注损伤中起到保护作用，但具体的机制尚不明确。新近研究证实了硫化氢在内质网应激过程中发挥了重要作用，硫化氢参与了内质网应激中相关信号转导通路及其细胞内钙稳态和细胞凋亡等过程。我提出了在肝缺血再灌注损伤中，硫化氢作用下的内质网应激及其凋亡相关分子参与了细胞保护作用的科学假说。本项目以硫化氢对大鼠肝脏缺血再灌注损伤为研究对象，利用组织形态、分子生物学等技术，通过观察硫化氢在大鼠缺血再灌注损伤过程中内质网应激相关蛋白及其介导的细胞凋亡信号通路关键分子表达的变化，阐明肝脏缺血再灌注损伤过程中硫化氢与内质网应激及其诱发凋亡的调控作用机制，从而为硫化氢作为肝脏缺血再灌注损伤的细胞保护药物用于相关治疗提供理论基础。

硫化氢在内质网应激过程中发挥了重要作用，硫化氢参与了内质网应激中相关信号转导通路和细胞凋亡等过程。实验组大鼠肝缺血后出现明显的肝组织损伤，且随着再灌注时间的延长损伤加重，表现为血清 ALT 和 AST 水平升高，明显的肝组织病理学改变，肝细胞凋亡率增加，硫化氢可以逆转ALT 和 AST 水平升高水平，大鼠肝组织 GRP78 mRNA 变化趋势与上述指标一致，缺血后表达明显上调，且随着再灌注时间延长而逐渐升高。我们进行预处理IR-rat硫氢化钠组和内源性H2S抑制剂PAG组。TUNEL染色后，用肝脏组织病理学分析，硫化氢降低了肝脏病理损害的发展，包括肝小叶和细胞结构的改变，在硫氢化钠和PAG一起处理后，缺血性再灌注后，TUNEL阳性细胞的数量减少到一个较低的水平，在定量分析中，我们进一步测量肝细胞的凋亡通过AnnexinV / PI染色，与TUNEL染色结果一致,肝脏细胞可以在缺血性再灌注下减少细胞凋亡，在缺血性再灌注的影响下，硫氢化钠组和PAG组处理后，部分凋亡细胞增加。利用实时RT-PCR技术对缺血再灌住损伤组在灌注后肝组织中Atf6, PERK, GRP78, Traf2, CHOP 和Caspases 12 的mRNA表达水平的测定，显示Atf6, Traf2 、GRP78和CHOP表达水平的明显上调。在IR-PAG组，Atf6和Traf2 mRNA水平也升高。而在IR-NaHS组，却没有这些基因水平的明显升高作用被抑制。这些结果表明,硫化氢可能通过抑制内质网应激相关基因和细胞凋亡相关基因减少肝脏缺血再灌住损伤。免疫印迹和实时PCR技术分析H2S下游靶基因在肝组织中的表达水平。在肝缺血再灌注损伤组ATF6, PERK, GRP78, TRAF2, CHOP和Caspases 12的蛋白水平明显升高。从ATF6、 GRP78蛋白表达水平分析，硫氢化钠减弱肝缺血再灌注损伤的刺激作用, 而PERK, TRAF2, CHOP and Caspases 12蛋白水平，并没有恢复作用。总之，在本研究中，硫化氢参与了大鼠肝脏缺血再灌注损伤作用，并通过ATF6，GRP78的蛋白作用记性调节的，其作用机制有待于进一步证实。