iPS细胞分化诱导法制备视网膜色素上皮细胞移植片的研究

年龄相关性黄斑变性（AMD）和部分类型视网膜色素变性（RP）等常见视网膜变性疾病的主要病因是视网膜色素上皮（RPE）的异常而最终导致视网膜神经上皮细胞的变性凋亡，治疗手段非常有限。目前，应用诱导多能干（iPS）细胞体外分化法进行视网膜细胞移植再生已经有望成为治疗视网膜变性疾病的有效方法。然而，大部分体外分化诱导RPE细胞法均使用了动物来源的蛋白成分或者是成分不明的培养基，限制了其临床应用。另外，细胞移植的方法尚未成熟，目前尚未开发出可用于移植的RPE细胞移植片。本研究课题采用小分子化合物来分化iPS细胞以诱导形成"自体"RPE细胞，避开使用动物来源的重组蛋白成分，同时结合可降解胶原生物材料来制备适合手术移植的细胞移植片，为体外分化诱导的RPE细胞移植临床应用做好前期基础工作。

背景和目的：年龄相关性黄斑变性（AMD）等常见视网膜变性疾病的主要病因是视网膜色素上皮（RPE）的异常而最终导致视网膜神经上皮细胞的变性凋亡，治疗手段非常有限。目前，应用诱导多能干（iPS）细胞体外分化法进行视网膜细胞移植再生已经有望成为治疗视网膜变性疾病的有效方法。然而，大部分体外分化诱导RPE 细胞法均使用了动物来源的蛋白成分或者是成分不明的培养基，限制了其临床应用。另外，细胞移植的方法尚未成熟，目前尚未开发出可用于移植的RPE 细胞移植片。.内容和结果：通过本课题为期一年的小额资助，本研究的进行完成如下工作：.一、成功采用小分子化合物将iPS 细胞诱导形成RPE 细胞：1．稳定培养人源诱导多能干（iPS）细胞。iPS 细胞和胚胎干细胞类似，在体外培养时需要严格控制培养条件。本研究利用本实验室现有的人源iPS 细胞，通过既往已验证的体外培养方法进行稳定传代培养。2．应用小分子化合物体外分化诱导iPS 细胞形成RPE 细胞。目前，大部分体外分化诱导RPE 细胞的方法都使用了动物来源的蛋白成分（污染源可能），或是效率极低、耗时较长的自然发生方法。基于申请人以往的工作基础，成功使用小分子化合物将iPS 细胞分化诱导成RPE细胞，解决了使用动物成分造成污染的问题。3. 分化来源RPE 细胞的扩增培养和鉴定。我们发现iPS 细胞分化来源的RPE 细胞具有较强的细胞增殖能力。利用这一特征，在培养皿中分化诱导的混合细胞中通过机械法挑出包含色素的细胞团，并使用胰酶消化后贴壁培养明胶涂层的培养皿中，通过4周培养可扩增形成较大量单层的RPE 细胞片。对不同分化时期的RPE分别进行紧密连接标志物ZO1等抗体染色，观察分化RPE细胞的形态和功能变化。.二、初步探索结合纳米胶原生物材料制备RPE 细胞植片的可行性。胶原是细胞基底膜的主要成分，可以作为RPE 细胞移植用载体。我们采用了生物可降解的、有良好的生物相容性的纳米胶原生物材料。将分化来源的RPE 细胞播种于胶原膜生物材料上培养形成RPE 细胞植片，通过MTT实验验证了RPE 细胞和生物材料的良好相容性和增殖能力。.科学意义：由于RPE 细胞用于细胞移植的时候缺乏移植载体，因此移植方法存在很大的缺陷，如细胞易流失或凋亡、生长错位等。本研究初步探索成功RPE 细胞和纳米胶原生物材料可良好结合，有望成为具有应用价值的细胞植片。