锦紫苏类病毒在原生质体中的重组潜能和规律

RNA recombination plays an important role in the viroid evolution, but recombination rules and mechanism are still not clear. Coleus blumei (coleus) is an ornamental plant that is susceptible to infection by six Coleus blumei viroids (CbVds), CbVd-1 to CbVd-6. Recombination is common in CbVds and findings of several CbVd chimeras provide direct and solid evidence of molecular genetics for viroid intermolecular recombination, and also provide perfect experimental materials for investigation of viroid recombination rules and mechanism. Since population structures of all CbVds display quasispecies characteristic, mixed infection among different CbVds in coleus is common, and infection cycles of some CbVds are much longer; therefore, we will analyze the genetic diversity of different CbVds so as to get the predominant sequences of each CbVd for the construction of infectious clones. Protoplast technology will be used to investigate the replication potential of different CbVds in coleus protoplast. Coleus protoplast/CbVds inoculation system will be constructed and used to investigate the recombination potential among different CbVds. Sequence characteristic of recombination site will be clear after molecular identification and sequence analysis of viroid progenies. Our study will provide theoretical basis for the clarification of recombination mechanism of viroid and even RNA viruses.

RNA重组在类病毒的进化演变中起着重要的作用，但类病毒的重组规律和机理尚不明确。锦紫苏是一类观赏植物，目前发现它能够被六种类病毒侵染（CbVd-1～CbVd-6），多个CbVds重组体的发现为类病毒分子间重组提供了直接确凿的分子遗传学证据，也为研究类病毒重组规律和机理提供了理想的实验材料。由于CbVds在基因多样性上表现出“准种”的特性，多种CbVds在自然界中呈混合侵染状态，且部分CbVds在锦紫苏植株上的侵染周期较长，因此本研究将分析自然界中CbVds的基因多样性，筛选不同CbVds的主流序列后构建其侵染性克隆，利用原生质体技术研究不同CbVds在锦紫苏原生质体中的复制潜能，建立锦紫苏原生质体/CbVds接种体系；进而利用该体系研究不同CbVds之间的重组潜能，明确已知锦紫苏类病毒之间的重组规律，分析重组发生位点的序列特征，为研究类病毒乃至RNA病毒的重组机理提供理论基础。

类病毒分子间重组对类病毒的遗传进化具有重要作用，锦紫苏类病毒（CbVd）能够混合侵染锦紫苏，并且存在分子内、分子间重组现象，是研究RNA病毒重组、变异及与寄主互作的模式材料。本研究以锦紫苏类病毒-1～4（CbVd-1～CbVd-4）为研究对象，将侵染性克隆技术和原生质体技术相结合，对CbVd在不同品种锦紫苏原生质体中的重组潜能及规律进行研究。为检测样品中含量低的CbVd，本研究利用小RNA（sRNA）测序技术对锦紫苏中的小RNA进行了测定并利用生物学软件对其中类病毒来源的小RNA（vd-sRNA）进行组装，建立了利用小RNA测序技术鉴定CbVd的方法，特别适用于寄主植物中含量低及未知类病毒。为获得不同CbVd的主流序列，本研究于2018年～2020年间从全国11个地区采集锦紫苏样品300份，检测后对不同地点采集的部分阳性样品进行了克隆测序，分析了不同CbVd在自然界中的序列多样性，利用不同CbVd的主流序列构建其二倍体及四倍体侵染性克隆，并将它们接种到6个不同品种的锦紫苏原生质体中，明确了CbVd-1在不同品种的锦紫苏原生质体中均可复制，“红叶绿锯齿边”的1号品种的锦紫苏原生质体是不同CbVd的最适寄主，由此建立了锦紫苏原生质体制备/CbVd接种体系。对原生质体中的子代类病毒的检测和vd-sRNA分析结果表明：CbVd-1和CbVd-3可以重组得到CbVd-2，中央保守区部分序列为DCL蛋白切割热点，且该序列存在不同类病毒的突变位点，推测CbVd的重组位点位于中央保守区。另外，CbVd-1等类病毒来源的vd-sRNA均以22-nt为主，说明锦紫苏中Dicer-like 2（DCL2）蛋白在vd-sRNA产生过程中发挥重要作用；22 nt小RNA源自中央保守区这一发现揭示了中央保守区不仅在类病毒的复制及重组过程中发挥重要作用，而且在类病毒小RNA产生、病原与寄主互作过程中发挥重要作用。对不同类病毒来源sRNA的分析结果还进一步证实了基因组序列是vd-sRNA生物合成的决定因素，以上结果为类病毒/寄主互作模式系统的建立奠定了理论基础，为进一步研究类病毒乃至RNA病毒的重组机理和进化规律提供了理论依据。