锦紫苏类病毒RNA重组及其致病性变异的分子基础

已发现的锦紫苏类病毒（Coleus blumei viroid 1-6）共6种，其中CbVd 5和6是申请人于近年在世界上首次发现的两个新种，也是我国报道的仅有的两个类病毒新种。从二级结构上看，CbVd 2、6分别是由CbVd 1/CbVd 3、CbVd 3/CbVd 5在自然条件下发生重组形成的；而CbVd 4则是根据结构域人工构建的重组体，也具有自我复制能力。虽然已认识到CbVd分子间存在着频繁的重组现象，但迄今为止对其重组发生的规律和生物学意义仍不清楚。本研究首先从不同地区大量采集锦紫苏样品，通过高通量测序研究自然状态下锦紫苏类病毒的重组和变异规律；同时构建CbVd 1到6的类病毒侵染性克隆，通过单独或两两组合的方式接种锦紫苏无毒苗，分析子代类病毒的重组和序列变异情况。通过以上两条途径，揭示在自然条件和人工接种条件下类病毒之间可能存在的重组及序列变异规律，以及致病性变异的分子基础。

锦紫苏是世界范围内广泛种植的一种观赏植物，目前为止，世界上共发现了6种侵染锦紫苏的类病毒，分别为：锦紫苏类病毒-1～6（CbVd-1～CbVd-6）。所有已发现的锦紫苏类病毒具有共同的中央保守区序列，而且锦紫苏类病毒具有广泛重组的特性。虽然CbVd-1已被证明广泛存在于世界各国，但其他五种锦紫苏类病毒的相关信息却十分有限，特别是CbVd-5和CbVd-6，目前还没有关于这两种类病毒生物学方面的报道。本研究建立了一种锦紫苏类病毒的快速杂交检测方法，将锦紫苏类病毒中央保守区上游的32个相同的核苷酸序列扩增8倍后用于制备检测所有锦紫苏类病毒的通用探针—8CCR探针。该探针可以通过斑点杂交一次性确定样品中是否携带锦紫苏类病毒，通过Northern杂交技术可以一次性确定样品中感染锦紫苏类病毒的种类。此快速检测方法简单高效，成本较低，适用于锦紫苏类病毒的批量检测及大规模调查，对其他类病毒，甚至病毒快速检测方法的建立也具有借鉴意义。利用这一快速检测方法，结合RT-PCR等其它分子生物学检测技术，本研究对锦紫苏类病毒的发生情况进行了疫情普查。从中国、印度及印度尼西亚共采集1118个锦紫苏样品，检测结果表明：CbVd-1和CbVd-5广泛存在于这三个国家中；CbVd-2，CbVd-3和CbVd-6仅在中国样品中检测到；所有的样品中均没有检测到CbVd-4。本研究结果是CbVd-1和CbVd-5在印度尼西亚的首次报道，也是CbVd-5在印度的首次报道。另外，本研究还利用侵染性克隆技术，首次确认了CbVd-1、CbVd-3、CbVd-5和CbVd-6中国地区分离物的生物学活性，证实了CbVd-5和CbVd-6可以通过种子进行传播。研究结果表明：不同锦紫苏类病毒在同一种寄主植物中的侵染时间从45天到300天不等，确认了CbVd-5和CbVd-6的生物学活性，为其分类地位的确立提供了确凿的分子生物学证据。子代序列分析结果表明：锦紫苏类病毒的遗传多样性不仅与寄主的选择压力有关，也与类病毒自身的特性有关。