杨树维管形成层天然反义RNA的基因功能与调控机理

Vascular development of trees is a complex process involving cell proliferation and differentiation. This process is significant for it decides quality and quantity of wood production. Recently, natural antisense transcripts (NATs) have been proved to occur prevalently in plant genomes and play significant roles in developmental processes. The applicant has carried out some researches on NATs in poplar and arabidopsis, and obtained valuable results. To make a further study of regulatory mechanisms of NATs in tree vascular development, cis-NATs of vascular tissues of hybrid aspen T89 (Populus tremula × P. tremuloides) will be obtained using strand-specific RNA sequencing, from which cis-NATs specifically expressed in vascular cambium will be obtained. Based on the approaches of candidate gene cloning, and genetic transformation of hybrid aspen T89, functions of candidate NATs will be analyzed. Further analyses of transformed hybrid aspen T89 plants, including small RNA sequencing of vascular cambium, regulation of NAT-encoded proteins and on expression of sense strand, interfering of NATs on expression of sense strand, influence of NATs on promoter methylation of sense strand, and expression patterns of sense and antisense gene pairs will be carried out to predict the regulatory mechanisms of NATs. This study will help us to understand the biological functions and molecular regulatory mechanisms in vascular development. This project will promote the research on the mechanism of wood formation, and provide new insights into tree breeding.

树木的维管发育是一个复杂的细胞分化和发育过程，该过程决定木材产量和质量，具有重要研究价值。近年来天然反义RNA（NATs）被证实在多种植物体内广泛存在，在植物生长发育过程中起重要调控作用。申请人在前期工作中已进行了几个杨树和拟南芥NATs的研究，并取得较好结果。为深入研究NATs在树木维管发育中的调控机理，本项目通过欧美山杨杂种T89杨维管组织链特异性转录组测序，挖掘维管形成层特异表达的顺式NATs，通过基因克隆和转化T89杨分析候选顺式NATs的功能，并通过转基因杨树维管形成层小RNA测序、NATs编码产物对正义链表达的调控、NATs对正义链表达的干涉、NATs对正义链启动子甲基化的影响以及正反义基因对的表达模式分析等手段，分析NATs对维管组织发育的调控模式。综合以上研究，探讨NATs在维管发育中的生物学功能和调控机理，推动木材发生的机理研究，为林木材性遗传改良提供新思路。

非编码RNA是近年来人们在转录水平进行基因调控研究的一个新热点。非编码RNA通过多种途径对基因表达进行调控，这些途径涉及染色体水平、转录水平、转录后水平以及翻译水平等等，且调控手段多样，如染色体异染色质化、DNA甲基化、形成small RNA等，其中small RNA的形成又在不同水平上参与了广泛的生物学过程。天然反义转录本（NAT）是人们近十年来才逐渐明确的一类新型基因调控模式。它可以是编码的，也可以是非编码的；可以转录长链RNA，也可以形成小RNA；可以进行顺式调控，也可以进行反式调控。近年来，研究人员通过链特异转录组测序方法在许多物种中对NAT进行了广泛的挖掘，特别是在模式植物水稻、拟南芥的研究中，人们对NAT的组织特异性、胁迫响应以及可能的调控机理进行了大量的研究，对于NAT调控模式和特定NAT功能的研究有了较多的案例积累。但是，作为新型的RNA，NAT在大多数植物中的研究非常有限，在杨树中也主要是通过基于生物信息分析的方法进行预测，对于杨树lncRNA的大量研究并没有深入进行NAT的预测及其调控模式和基因功能的研究。.本项目基于杨树转录组测序分析，特别是针对杨树次生生长转变过程，就一系列茎节间取样，并进行链特异转录组测序和小RNA测序分析。同时，项目通过对杨树叶柄维管发生进行系统的组织解剖分析，选取了与茎初生生长相对应的三种类型的叶柄进行转录组测序分析，以排除杨树茎次生生长过程中所伴随的初生生长相关的差异表达基因，从而提高了对于杨树次生生长相关基因筛选的特异性。项目组关于NAT候选基因也做了精细的筛选，筛选标准包括正反义链的表达量，正反义链表达量的相关性，以及正反义链的类型，特别是miRNA-lncRNA基因对的研究具有较高的创新性。基于表达量筛选出来的AP1基因及其NAT在次生生长过程中有较高的表达特异性，实验数据表明其NAT的形成依赖于AP1第二个外显子。另外VCD5基因自身参与维管发育，包括形成层活性和韧皮部形态建立，而VCD5的NAT则参与植物分枝过程。通过本项目的实施，我们对于木本植物次生生长发生在转录水平的调控有了更深的认识，特别是NAT这种新型调控方式的研究将进一步促进人们对于次生生长和维管组织发育分子调控网络的建立。.