樟树体细胞胚发生早期的转录组分析及相关基因的功能研究

研究体细胞胚发生机制对揭示植物胚胎发育机理具有重要意义。胚性细胞的起始分化是体胚发生和发育的关键时期，对体胚的发生频率和发育途径起决定作用。申请人在诱导樟树体胚发生时，发现对未成熟合子胚进行蔗糖溶液预处理，可极显著提高其体胚诱导率（从不预处理的16%到93%），这是目前报道的诱导樟树体胚高效发生的最有效途径。本项目旨在利用蔗糖溶液预处理合子胚引起体胚高效发生这一现象，挖掘樟树体胚发生的相关基因。通过未成熟合子胚的转录组测序，预处理和不预处理合子胚的表达谱测序，结合生物信息学分析，寻找樟树体胚发生的相关基因；通过Real-time PCR，RNA原位杂交分析候选基因表达模式；在此基础上，初步解析候选基因在诱导樟树体胚发生中的作用。通过本项目的实施，可为樟树的基因功能及结构研究奠定基础，实现体胚发生相关基因的挖掘，为阐明早期体细胞胚发生的分子机制提供理论基础和基因资源。

研究体细胞胚发生机制对揭示植物胚胎发育机理具有重要意义。胚性细胞的起始分化是体细胞胚发生和发育的关键时期，对体细胞胚的发生频率和发育途径起决定作用。利用蔗糖溶液对樟树未成熟合子胚进行预处理，可极显著提高其体细胞胚诱导率（从不预处理的16%提高到93%）。本项目利用蔗糖溶液预处理合子胚引起体细胞胚高效发生这一过程，分别对樟树未成熟合子胚、预处理的未成熟合子胚、体细胞胚进行了Illumina Hiseq 2000从头转录组测序，总共获得了30.70G有效Reads，经拼接得到205592条转录本和114229个Unigene，转录本和Unigene平均长度分别为998bp和680bp。通过与Nr、Nt、SwissProt、GO、COG/KOG和KEGG数据库进行比对，33.28%（38020）的Unigene得到了注释信息、分类信息或代谢通路信息。通过基因名搜索和序列比对，共鉴定得到897个体细胞胚发生相关基因。通过与拟南芥同源基因进行Blast比对，对这897个基因按基因家族进行了系统发育树分析。通过转录组比较分析，共得到3335个在3组样品中差异表达的Unigene。利用K-means clustering方法，这些差异表达基因可根据其表达模式分为6组。对差异表达基因的GO富集分析显示，在樟树体细胞胚发生过程中，胁迫与刺激响应基因显著富集。为验证转录组测序获得的结果，利用qRT-PCR对52个体细胞胚发生相关基因的表达模式进行了验证，转录组测序和qRT-PCR的结果相关性较强。在此基础上，挑选了BBM基因作为关键候选基因，通过RACE技术扩增基因全长，得到了cDNA全长为2532bp、DNA全长为5242bp的CcBBM。半定量RT-PCR分析显示，CcBBM在幼根和体细胞胚中特异表达。为验证CcBBM的功能，利用Gateway克隆体系进行了CcBBM过量表达载体的构建，并对樟树胚性愈伤组织和拟南芥进行了CcBBM基因的遗传转化。初步结果显示，过量表达CcBBM导致樟树胚性愈伤组织生长缓慢，拟南芥出现短根、褶皱叶和锯齿叶等表型。本项目的研究为樟树的基因功能及结构研究提供了详细的转录组信息和基因表达数据，实现了体细胞胚发生相关基因的挖掘，为阐明早期体细胞胚发生的分子机制提供了理论基础和基因资源。