骨基质酸性蛋白DMP1在内耳发育中的作用

The delicate structure of the inner ear is extremely complex. Dysplasia can cause inner ear malformation. The cochlear nerve dysplasia in patients with artificial cochlear implants effect is poor cochlear nerve normal patients.Thus it is urgent to find the cause of the cochlear nerve hypoplasia and related genes. Previous studies have found that bone matrix acidic protein DMP1 may be associated with disease,and DMP1 is widely expressed in early embryogenesis of the inner ear. So this topic aims to reveal the DMP1 role in the inner ear development mechanism. ①In Vivo, We explore the mechanisms of the DMP1 regulation based on temporal (different embryonic stages)and spatial(whole tissue、precursor cells、hair cells and supporting cells) control of DMP1 using the different Cre recombinase transgenic mice models. We observe the mutant mice phenotypes; proliferation characteristics of differentiation; expression of cell adhesion proteins; Wnt signaling pathways and BMPs signaling pathways related protein expression changes② In vitro (Mechanism exploration): we further validate whether Wnt and Bmps signaling pathways has synergistic effect with DMP1 involved in inner ear formation ,through in vitro culture of the vestibular and cochlear epithelium of the mutant mice adding the activator and inhibitor of the Wnt and BMPs signaling pathway .The ultimate aim is to reveal the new features and function of DMP1 gene in the inner ear development.

内耳精巧结构的发育极其复杂，发育异常可以引起内耳畸形。其中蜗神经发育不良患者人工耳蜗植入效果较蜗神经正常患者差。因此迫切需要寻找蜗神经发育不良的致病因素和相关基因，前期研究发现骨基质酸性蛋白DMP1可能与发病有关，并且 DMP1在内耳胚胎早期就有广泛表达。因此本课题旨在揭示DMP1在内耳发育中的作用机制。拟通过①体内实验：选用DMP1条件性敲除小鼠，选用不同组织特异性的cre酶转基因小鼠，在内耳不同部位和时间敲除特定细胞中的DMP1来观察表型改变；突变鼠增殖分化特点，细胞粘附表达特点；Wnt和 BMPs信号通路相关蛋白表达改变。②探讨机制，表型改变的小鼠前庭和耳蜗上皮体外培养，加入Wnt信号通路激活剂或抑制剂；BMPs信号通路抑制剂或外源性BMPs,探讨Wnt信号通路和BMPs信号通路调控DMP1参与内耳发育的机制。最终目的为了揭示DMP1基因在内耳发育中的新功能和作用机制。

内耳精巧结构的发育是一个极其复杂的过程，因此探究和掌握内耳发育规律是实现“功能性感受器整体再生”的基础。DMP1（牙本质基质蛋白1）是一种高度磷酸化的酸性胶原磷蛋白。最近研究发现DMP1在软组织中也有表达，有病例研究报道称患有隐性低磷血症佝偻病的成年患者会出现听力障碍，揭示DMP1在内耳疾病中可能发挥作用。因此，我们提出通过降低条件性敲除小鼠中DMP1的表达来研究其对胚胎发育过程中内耳发育和极性排列的影响。我们采用免疫荧光染色观察DMP1在内耳的时空表达规律。并且通过将Foxg1Cre/+工具鼠和DMP1flox/flox小鼠杂交获得双阳性小鼠在内耳的Foxg1+细胞中特异性敲除DMP1，解剖P1突变小鼠的听泡，观察其大小和形态的变化。进一步解剖耳蜗基底膜，进行免疫组化染色，观察毛细胞发育（数量、大小和纤毛束）、平面细胞极性蛋白(单个细胞平面极性蛋白、核心PCP蛋白)、细胞粘附蛋白和细胞连接蛋白的变化。并通过RNA-seq寻找差异基因探索可能的调控通路以及可能的靶基因。我们的研究结果发现DMP1在内耳毛细胞中均有表达，且DMP1蛋白的表达在不同的发育阶段发生了变化。与野生型小鼠相比，DMP1cKO小鼠耳蜗毛细胞整体排列无明显改变，但静纤毛正常V字形结构紊乱，呈现扁平一字形，动纤毛偏离V字形顶点。同时发现突变小鼠单个细胞极性蛋白gai3和Pard6b的表达位置发生了变化。而钙粘蛋白相关蛋白β-连环蛋白、紧密连接蛋白zo-1和PCP核心蛋白vangl2的表达无显著性差异。我们的研究表明DMP1调控发育中的耳蜗静纤毛取向、动纤毛定位和单个细胞平面极性，而不参与耳蜗平面细胞极性形成的汇聚延伸和相邻细胞极性的调控，揭示了DMP1的新功能和作用机制。为内耳感受器功能性再生提供理论基础，为感音神经性耳聋的基因治疗提供有力的支持。