Wnt信号通路在小鼠前庭感受器平面细胞极性发育中的作用

Our previous study show that the five vestibular organs have unique cell polarities regulated by the planar cell polarity pathway(PCP),which play important roles to maintain their functions. The PCP in the cochlear is regulated by the non-canonical Wnt/PCP pathway.Wnt pathway related genes are expressed in the development of the vestibular organs and cochlear. Wnt5a interacts genetically with Ltap/Vangl2 for uniform orientation of stereocilia,It is unknown how the core PCP proteins through Wnt signals exert the roles between cell-cell signal transmission in the cell polarity..In this study, we used the utricle as a model system and explored the involvement of Wnt morphogenesis in PCP regulation..①Previous studies in the development of utricle revealed that there are two important embryonic time points and positions during the utricle hair cells differentiation and cell polarity formation. We screen the Wnt related genes in the characteristic periods and positions of the utricle using RNA-seq methods..②We detect the quantity and position of the screened Wnt related genes in the development of the utricle epithelium ..③We explore the roles of Wnt pathway in the utricle PCP by modulation of Wnt signaling in vitro..④We further explore the mechanisms of the Wnt pathway in the PCP regulation by the knockout mice models. .Anticipated results: We provide in vitro and in vivo evidence supporting a role for Wnt pathway in PCP regulation in mice vestibular organs.

我们前期研究发现前庭感觉器官具有独特的细胞极性，由平面细胞极性途径（PCP）参与调控，对维持其功能有重要作用。在耳蜗PCP途径中主要受非经典Wnt/PCP信号通路调控而发挥作用，Wnt相关基因在内耳发育中均有表达，Wnt5a与Vangl2一起参与耳蜗的PCP，调节耳蜗毛细胞极性，但在前庭中PCP核心蛋白是否通过Wnt通路介导细胞与细胞之间的信号传递而发挥作用和如何作用目前不明，因此本研究主要揭示Wnt信号途径在前庭平面细胞极性调控中的作用。.具体包括：①前期研究发现椭圆囊斑发育两个重要时期和部位，行高通量转录组RNA-seq检测筛查差异基因，发现该特定时期Wnt通路重要基因②Wnt通路基因在椭圆囊上皮的定量和定位检测。③体外干预Wnt信号途径对毛细胞极性的影响。④利用基因敲除小鼠探讨Wnt信号途径发挥平面细胞极性的机制。.预期目标：体内和体外验证Wnt通路参与前庭PCP调控及其机制。

内耳毛细胞规律的极性排列对于听力的传导和维持平衡非常重要，前庭器官具有独特的极性排列，是唯一能在同一器官可以见到三种不同形式的极性规律，我们通过研究前庭感受器胚胎发育规律以及不同阶段wnt信号通路重要蛋白的定位和定量表达，体外通过wnt信号通路激活剂和抑制剂调控前庭感受器的极性发育，体内通过wnt5a敲除小鼠和经典wnt信号通路关键蛋白Wnt/β-catenin条件性敲除小鼠来进一步研究前庭极性发育规律。研究结果揭示前庭椭圆囊斑毛细胞分化与增殖规律，说明在小鼠椭圆囊上皮毛细胞最早退出细胞周期在微纹区，其次是微纹内侧区，最后是微纹外侧区，毛细胞分化最早在E11.5微纹区，其次是微纹内侧区，微纹外侧区较晚（E15.5），Wnt 信号通路重要蛋白在前庭感觉器官上皮发育中均有表达，非经典/Wnt5a信号途径不参与前庭的平面细胞极性途径。研究也发现在Ankrd6 基因敲除的小鼠内耳椭圆囊上皮中也发现毛细胞部分排列紊乱，并且发现Ankrd6 是通过抑制经典Wnt/β-catenin 信号途径来发挥作用。椭圆囊斑E13.5 体外培养中加入经典Wnt 激活剂和抑制剂后培养5 天，与对照组相比相邻细胞排列发生紊乱，我们选用毛细胞标记的Gfi-cre 小鼠和前体细胞标记的sox2-CreER条件性敲除β-catenin 见毛细胞排列发生紊乱，并且极性蛋白Prickle的表达位置也发生改变。结论：经典Wnt/β-catenin信号参与了前庭极性的发生, 阐明Wnt/β-catenin 调控前庭感受器平面细胞极性发生的具体分子机制，为研究新生毛细胞的极性重排导致听觉和平衡功能的恢复奠定基础。