草酸青霉纤维素酶转录激活因子ClrB功能结构域的解析和优化

Highly efficient, low-cost production of lignocellulolytic enzyme systems has a key role in the economic bioconversion of lignocellulosic biomass to fuels and chemicals. Cellulase production in filamentous fungi is mainly regulated at transcription level, in which a transcription activator ClrB has a conserved and critical function. However, the functional domains responsible for the activity regulation and transcriptional activating effect of ClrB are still unknown. In this study, we will construct a series of ClrB mutants with sequence deletion, mutation or chimerization by applying Penicillium oxalicum ClrB as a model. The mutants will be analyzed by electrophoretic mobility shift assay as well as measurements of cellulase gene expression and cellulase production to identify the domains for DNA-binding, activity regulation and transcription activation. Then, redesigned transcription factors with altered domain compositions will be constructed and analyzed for their transcriptional activating abilities and responses to various carbon sources. The work is expected to elucidate the molecular mechanism for the transcriptional activation of cellulase genes by ClrB, and to provide novel constructs for the development of cellulase high-producing strains.

木质纤维素降解酶系的高效生产在非粮生物质的生物炼制中具有关键作用。丝状真菌胞外纤维素酶的合成主要在基因转录水平受到调控，其中转录因子ClrB具有核心、保守的转录激活功能。然而，ClrB实现其活性调节和转录激活作用的功能结构域目前尚不清楚，严重限制了对其调控机制的深入理解与分子改造工作的开展。本项目拟以草酸青霉ClrB为研究对象，在生物信息学分析的基础上，通过构建系列有针对性的序列删除、突变、嵌合突变体，整合凝胶迁移、酶活力测定、基因转录水平测定、报告基因产物水平测定等技术手段，对ClrB的DNA结合域、活性调节域和转录激活域进行鉴定。在此基础上，构建基于功能域优化设计的纤维素酶转录激活因子，研究其转录激活能力和对不同碳源的响应。本研究预期将解析ClrB转录激活纤维素酶基因表达的功能结构域并阐述其作用机制，同时可为纤维素酶高产菌株的构建提供新颖的功能元件。

对丝状真菌木质纤维素降解酶表达的调控网络进行改造，是提高其产量的有效方法。ClrB是丝状真菌中核心、保守的纤维素酶转录激活因子，对其功能的解析与改造具有重要意义。草酸青霉能够分泌复杂多样的木质纤维素降解酶系，已被应用于纤维素酶制剂的生产。本项目以草酸青霉ClrB为研究对象，在生物信息学分析的基础上，对其结构与进行了解析和优化。研究结果包括：（1）利用酵母报告基因系统，鉴定到了草酸青霉ClrB的C端序列为其转录激活结构域，并发现这一结构域架构在粗糙脉胞菌同源物CLR-2中同样存在，但二者的激活域序列完全不同。（2）将ClrB的N端锌簇家族DNA结合结构域和本项目鉴定到的C端激活结构域直接连接，设计构建得到了突变体ClrBID。该突变体不仅能够使纤维素降解酶在无诱导条件下表达，而且能够激活纤维素降解酶在葡萄糖和甘油两种易碳源存在下的表达。以上研究结果在基因转录、蛋白质、酶活力三个水平均得到了证实。（3）将ClrBID的表达与碳分解代谢物阻遏因子CreA的基因敲除进行了组合，研究了二者的遗传相互作用，发现两种转录因子扰动形式对于纤维素降解酶的表达具有叠加作用。在以上研究基础上，在黑曲霉中表达了了其ClrB同源物编码基因的内部序列删除突变体，发现其可以激活甘露聚糖酶的表达。以上研究结果有利于深入理解丝状真菌木质纤维素降解酶合成调控机制，并为理性构建纤维素酶高产菌株提供了有效策略。