草酸青霉纤维素酶转录因子复合体结构解析及调控机制研究

Cellulases are the most abundant extracellular degrading enzymes in cellulolytic fungi, the production of which was mainly regulated in the transcriptional level. The central role of cellulolytic transcription factor in the process of gene expression is to regulate the transcription by binding directly to DNA sequences. These transcription factors could function to regulate cellulase gene expression by interacting with other proteins as a complex, and the mechanisms for cellulase transcription factor complex (CTFC) of which are still not known. In order to obtain its function on regulating the expression of cellulase, we would firstly identify the components of the CTFC, in addition to the known transcription factors ClrB, ClrB-2, CreA, XlnR and AmyR. Then, the function of the CTFC will be further characterized by some techniques CHIP-exo, EMSA and so on. We will also find some novel proteins and that interact with ClrB, ClrB-2, CreA, XlnR or AmyR and identify their roles in regulating the expression of cellulase. The comprehensive investigation of the mechanism of transcriptional regulation of CTFC on cellulase encoding genes will facilitate to redesigning the cellulase expression regulation network and provide theoretical guidance for constructing industrial strains with high cellulase production.

草酸青霉是具有纤维素酶工业生产应用价值的重要菌株，其纤维素酶的表达受制于纤维素酶转录因子在基因转录水平的直接调控。纤维素酶转录因子因其精密、复杂的蛋白质相互作用，通常以复合体的形式发挥其调控功能。然而，纤维素酶转录因子复合体的组成及协作调控纤维素酶表达的机制还不清楚。本项目以草酸青霉主要纤维素酶转录因子ClrB、ClrB2、CreA、XlnR和AmyR的功能研究为出发点，基于草酸青霉cDNA文库的酵母双杂交筛选、免疫共沉淀、以及细胞内双分子荧光互补技术筛选并确定参与纤维素酶转录因子复合体的蛋白组分，并结合比较基因组学、蛋白质组学、转录组学、生物信息学与生化功能实验相结合的研究方法，系统研究纤维素酶转录因子复合体调控纤维素酶基因表达的生物学功能和作用机理。希望通过本项目的实施，有助于全面了解纤维素酶的表达调控机制，为重构纤维素酶的表达调控网络和构建高产纤维素酶菌株提供基础数据和新的改造靶点。

草酸青霉木质纤维素酶是纤维素诱导条件下最丰富的胞外酶类。特别是草酸青霉菌株114-2是筛选出的高产纤维素酶菌株。前期研究结果表明，草酸青霉木质纤维素酶的表达调控主要发生在转录水平上，并且通过转录调控因子直接与DNA序列的结合以及与其它蛋白形成纤维素酶转录因子复合物（CTFC）发挥调控作用。因此，本项目的主要目的是研究草酸青霉纤维素酶关键转录因子如何作用于纤维素酶的表达。为此，我们首先分别构建了融合有FLAG-HA标签的ClrB，ClrB-2，CreA，XlnR和AmyR组成型表达菌株和诱导型表达菌株，并通过草酸青霉胞内蛋白的纯化以及蛋白质组的测序进一步筛选了与ClrB互作的蛋白质。结果表明，ClrB能与PDE_01024等编码的蛋白质协同调节纤维素酶的表达，并且与信号转导途径中的蛋白也存在相互作用。由此，为系统挖掘草酸青霉信号传导途径中的参与木质纤维素酶表达的蛋白，我们进一步构建了草酸青霉基因组中220个编码信号转导蛋白基因的单基因敲除突变株库，并对影响纤维素酶表达的突变株进行了初步筛选分析。我们还发现，转录因子突变体XlnRA871V显著提高了草酸青霉木质纤维素酶基因的表达强度，并结合转录因子ClrB和XlnRA871V及其靶标基因的过表达，构建了纤维素酶高产突变株RE-6，RE-7和RE-8，并将所构建的突变株应用于农业废弃物的降解。本项目所取得的研究结果有利于丰富丝状真菌木质纤维素酶转录因子调控网络以及产酶工业菌株的构建。