γ-tocotrienol（GT3）对dko DMD小鼠肌肉干细胞的保护作用

Although we and others have established stable methods to diagnosis (prenatal and genetic) Dys (Dystrophin anti-dystrophin) gene mutation Duchenne / Becker muscular dystrophy (DMD / BMD) mediated by Dystrophin gene mutation, no effective treatment regimen has been.developed so far. Hormone therapy is more commonly used in the clinical treatment of choice while its efficacy is poor. Cell therapy and gene therapy is only at the stage of animal experiments and the outlook is not optimistic. We and other groups have shown that abnormal muscle stem cells might play an important role in the pathogenesis of DMD disease. Our results indicate that muscle stem cells have higher oxygen free radicals (ROS) and cellular senescence in DMD dko mouse model compared to normal mice. This project will systematically analyze muscle stem cell function and phenotypes in different ages of DMD mice, including in vitro muscle stem cell colony forming ability, in vivo stem cell transplantation, ROS, cell senescence, apoptosis, DNA damage and cell cycle. It is well known that γ-tocotrienol (GT3) has capacities to effective antioxidant, anti-apoptosis and protect hematopoietic stem cell against stress. We will therefore use the GT3 to treat dko mice at different ages. Combining with in vitro colony formation and in vivo cell transplantation, we will illustrate muscle stem cell function. To provide further exploration of effective DMD treatment, we will analyze muscle stem cell phenotypes after GT3 treatment and elucidate the underpinning molecular mechanisms through the related gene expression analysis.

由Dystrophin抗肌营养不良蛋白基因突变引起的杜氏/伯氏进行性肌营养不良症（DMD/BMD）到目前尚未见有效的治疗方案。激素治疗为较常用临床治疗选择，但其疗效不佳；细胞治疗和基因治疗还只是处于动物实验阶段，前景并不容乐观。我们和其他小组试验结果显示肌肉干细胞异常在DMD模型小鼠发病过程中起重要作用，主要表现为DMD模型dko小鼠肌肉干细胞内氧自由基(ROS)产生增加和细胞衰老。本研究将对不同年龄dko小鼠肌肉干细胞的功能和表型进行分析，包括肌肉干细胞体外克隆形成、体内干细胞移植、ROS、细胞衰老、细胞凋亡、DNA损伤和细胞周期等。γ-tocotrienol（GT3）能有效抗氧化和抗凋亡，对造血干细胞损伤有显著保护作用。我们将用GT3对不同年龄dko小鼠处理后，结合体外克隆形成和体内细胞移植试验对肌肉干细胞功能和表型进行分析。同时，结合基因表达分析其作用机制，探索有效的DMD治疗途径。

Duchenne型肌营养不良症是一种致死性X染色体隐性遗传病，是人类肌营养不良症中最常见和最严重的类型。该病是由位于X染色体p21区的DMD基因突变所致，DMD基因是目前已知的人类最大基因，编码抗肌萎缩蛋白，其主要在骨骼肌和心肌组织表达。到目前为止，临床上尚无有效的针对DMD的治疗方法，肌肉干细胞移植在DMD中有一定的作用但效果不够显著。前期研究显示维生素E类似物（Tocols）具有有效的放射预防和保护作用，主要通过其抗氧化作用和抑制HMG-CoA还原酶活性来发挥其生物学活性，由于其无毒副作用有很强的临床应用前景。以前大量研究集中在α-tocopherol，然而近年来研究显示γ-tocotrienol（GT3）较α-tocopherol有显著的放射保护作用。以此为基础我们将开展四方面的研究：1.分析dko小鼠肌肉干细胞表型和相关基因表达变化；2.检测dko小鼠肌肉干细胞的功能变化；3.γ-tocotrienol (GT3)对dko小鼠肌肉干细胞体内和体外功能的影响；4.探索γ-tocotrienol (GT3) 对dko小鼠肌肉干细胞的作用机制。实验数据：与正常对照组小鼠比较，DMD基因敲除小鼠肌束周长增加且胫骨前肌PCNA阳性细胞数增加；DMD基因敲除小鼠肌肉干细胞数量减少； 与正常对照组小鼠比较，DMD基因敲除小鼠胫骨前肌肌肉干细胞Annexin V阳性比例、DCFDA、C12FDG、γH2AX荧光水平增加；经GT3处理后DMD基因敲除小鼠胫骨前肌周长增加而PCNA阳性细胞数降低，肌肉干细胞数量增加。此外，DMD小鼠Annexin V阳性比例、DCFDA、C12FDG、γH2AX荧光水平下降。 研究结论1）与正常同龄小鼠比较，DMD小鼠肌肉干细胞数量减少，增殖速度加快；2）与正常鼠肌肉干细胞比较，DMD鼠肌肉干细胞有较高的ROS水平、细胞老化、细胞凋亡和DNA损伤；3）GT3作用能升高DMD小鼠肌肉干细胞数量，降低其增殖速度；4） GT3作用能降低DMD小鼠肌肉干细胞氧化自由基、细胞凋亡和DNA损伤。科学意义：我们的研究首次证明，通过应用GT3来降低DMD小鼠肌肉干细胞的高水平ROS，减少干细胞凋亡，降低干细胞老化和DNA损伤，这也许有利于促进DMD患者肌肉干细胞功能的恢复。