不可分型流感嗜血杆菌E蛋白诱导中耳炎炎症反应及相关信号通路分子机制的研究

不可分型流感嗜血杆菌(NTHi) 是造成中耳炎(OM)主要致病菌之一,该菌在儿童的感染率呈上升趋势。文献报道：中耳炎病原体成分或细胞因子是导致内耳机能障碍的客观原因，但其潜在机理不明。且新发现的NTHi外膜 E蛋白(PE)可参与上皮细胞粘附、促炎症细胞因子表达。本课题拟在前期研究的基础上，根据NTHi P38 MPKA和NF-kB炎症反应信号通路的理论，通过NTHi野生株和PE缺陷株作用于A549、HMEEC-1细胞、小鼠中耳上皮细胞，诱导中耳炎炎症反应。比较TLRs在共聚焦显微镜免疫荧光强度及RT-PCR mRNA的差异表达,借助流式细胞、ELISA方法对不同时间点的细胞因子ICAM-1、IL-8、TNF-α、炎性细胞的动态检测，以探明PE促炎症反应的信号通路及分子机制，揭示PE对中耳炎致病作用，可望为生物制药靶位选择及临床有效干预中耳炎的发生，提高儿童的健康素质，提供科学依据。

不可分型流感嗜血杆菌(NTHi ) 是造成中耳炎(OM)主要致病菌之一, 该菌在儿童的感染率呈上升趋势。本课题从临床鼻窦炎和中耳炎患者中分离出流感嗜血杆菌，通过荚膜PCE鉴定筛选出不可分型流感嗜血杆菌，提取总 RNA。进行 RT-PCR 逆转录，以证明其E蛋白mRNA 的表达，并对疾病及健康标本的E蛋白mRNA的定量PCR结果进行了对比。从分子水平上提示，E蛋白mRNA的增高与疾病的发生炎症的程度是相关的。同时，为了从蛋白水平验证E蛋白在疾病炎症的情况下的表达水平增高，本研究中将流感嗜血杆菌临床菌株的E蛋白基因克隆入原核表达载体Pet-28a(+)，转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，用含相应抗性的LB平板筛选转化子，经IPTG诱导表达后，，检测E蛋白在活细菌中的表达水平，用高压液相法纯化出E蛋白单体，吸取上清，与弗氏完全佐剂混匀之后免疫家兔，获得多克隆抗体。