树坚果类主要过敏原鉴定、序列分析及其抗原表位定位

Food allergen has become one of the important food safety problems. Food allergic disease seriously affected the people's quality of life and even threatened their life. Labeled nuts food allergen composition, content is an effective way to avoid this kind of harm. At present, the research of allergen sensitization sites is looked upon as the golden key to “solve the problem of food allergies”. The early stage of the applicant has developed a set of immunoassay technique for detection of nuts allergens and the preliminary immune characteristics were identified and explored. On this basis, we will carry out screening sequence and structure analysis from the allergic to tree nuts main protein, build animal experimental model, through the analysis of the amino acid automatic sequencer with spectroscopy combined technology to find allergic protein structure or space conformation, the bioinformatics method and phage display technology experiment method with multiple parameter synthesis method organic union, accurate positioning allergens table, sensitization to elucidate the material basis, exploring tree nuts allergens table information, search for removal reduction methods of tree nut allergy protein, improve the food allergen databases. The results of the project will provide important technical support, which may contribute to prevention food allergies to play a positive role for our country.

食品过敏性疾病已成为公众性、全球性的健康问题，严重影响了部分人群的生活质量甚至危及生命。标注坚果类食品过敏原成分、含量是避免这种危害的有效途径。目前对过敏原致敏位点的研究视为开启“解决食物过敏问题”的金钥匙。申请人前期研发了一套免疫分析检测坚果过敏原的技术方法，并对树坚果过敏原分离鉴定及免疫特性进行了探索研究。在此基础上，开展对树坚果主要过敏蛋白筛选鉴定及结构序列分析研究，构建树坚果过敏原动物实验模型，通过氨基酸分析测序仪结合光谱学联合技术找出过敏蛋白结构或空间位点，把生物学信息方法和噬菌体展示技术实验方法与多参数模拟综合方法有机的结合起来，精确定位过敏原表位，阐明其致敏的物质基础，发掘树坚果过敏原表位信息，探寻脱除和降低树坚果过敏蛋白的方法，完善食品过敏原数据库。项目完成后为树坚果类食品过敏原标签标示制度的实施提供重要的技术支撑，为我国食品过敏人群对坚果过敏原的预防发挥积极作用。

果是食物八大过敏原之一，当前对树坚果类过敏表位预测分析及致敏机理还缺乏清晰、系统的研究。本项目以树坚果过敏蛋白的分离检测为基础，通过光谱技术和质谱技术结合研究其氨基酸序列及致敏特异性，预测过敏原表位位点，揭示致敏机理。明确了树坚果主要过敏蛋白：分子条带为13ku、54ku、19-22KD和38-41KD,预测位点是Pis v 5.0101。氨基酸定量分析获的致敏蛋白的17种氨基酸中精氨酸、缬氨酸、丝氨酸在表位中出现频率较大，存在致敏因子，通过质谱分析，获得了21KD蛋白条带的多肽序列：GAYSLSLR、GFFLFVEGGR、GSSIFGLAPGK和LNTLETEEWFFK。利用质谱测数据与NCBI-Anacardium occidentale数据库进行对比并利用生物信息软件DNAStar中的Protean预测结合圆二色谱分析得到β-转角和无规则卷曲容易与抗体结合，易形成构象表位，α-螺旋结构不易变形，很难与抗体结合，不易形成表位，更可能为线性表位，故β-转角和无规则卷曲多的区域有构象表位，发生B细胞免疫。采用噬菌体展示方法挑选出主要的表位为：Ana o 2：108-111、113-119、181-186、218-224；Ana o 3:10-24、13-27、39-49、66-70、101-106、107-114、114-122，及将主要表位中含量高的精氨酸与谷氨酸确认为关键氨基酸；Ana o 3比Ana o 2更容易引起过敏反应。微波超声波、高温高压、酶处理均可以降低坚果致敏性，多酚类物质比如海藻，石榴汁可结合过敏蛋白；通过体外肠模拟消化实验验证过敏性蛋白不容易消化吸收。小鼠腹腔肥大细胞体外激发后脱颗粒,并释放出组胺,类胰蛋白酶活性升高，肠、肝、肺部发生炎症症状,在体内诱发产生IgE抗体,并启动过敏介质的释放机制,导致过敏反应(Ⅰ型变态反应)的发生。