Dvls与Lats1竞争结合WWC3调控Hippo通路机制及对肺癌恶性表型的影响

WWC1 of WWCs family could interact with Lats1 and activate Hippo pathway. The roles of WWC3 in human tumors remain elusive. We found that WWC3 is downregulated in human non-small cell lung cancer and correlates with poor prognosis. WWC3 could interact with Dvls. We postulate that Dvls and Lats1 interact with WWC3 competitively, thus inhibit hippo signaling and promote malignant phenotype of lung cancer cells. We will upregulate and downregulate Dvls and WWC3 expression, construct and transfect WWC3 mutants which could not bind with Lats1 and Dvls, employ immunoprecipitation, GST pull-down, luciferase reporter assay and realtime RT-PCR, to elucidate the mode and mechanism of WWC3-Dvls-Lats1 interaction and its effect on Hippo and Wnt pathways. We will also try to explore the molecular mechanism of WWC3 downregulation and its effect on proliferation and invasion inhibition, which provides basis for development of new biomarker and drugs for non-small cell lung cancer.

WW和C2结构域蛋白家族（WWCs）中的WWC1可与Lats1结合激活Hippo通路，而WWC3在人类肿瘤的作用尚无报道。我们发现，WWC3的低表达与肺癌的淋巴结转移和不良预后相关，并且发现WWC3与Dvls存在相互作用。故提出Dvls可能与Lats1竞争性结合WWC3，抑制Hippo通路活性，促进肺癌细胞的恶性表型。我们拟双向调控WWC3和Dvls的表达，构建和转染WWC3与Lats1和Dvls结合位点的突变体等策略，采用免疫共沉淀，GST-Pull-Down，荧光素酶报告基因，实时定量PCR等方法，在体内外阐明WWC3-Dvl-Lats1相互作用模式和机制、对Hippo和Wnt通路活性的影响。揭示WWC3低表达和抑制非小细胞肺癌增殖、侵袭和转移的分子机制，为寻找新的非小细胞肺癌的生物标记及药物的开发提供实验基础。

WWC3是最初在果蝇中发现的支架蛋白，属于WWCs蛋白家族中的一员，并且在进化中高度保守，其在恶性肿瘤组织中的表达及其可能发挥作用的分子机制尚不清楚。我们发现WWC3在肺癌细胞系和肺癌病例标本中均表达减少，其低表达与非小细胞肺癌的低分化，高p-TNM分期，淋巴结转移密切相关。同时，Cox分析显示WWC3的低表达与高pTNM分期，淋巴结转移一起均为肺癌患病的风险因素。通过体外和体内实验（集落形成实验、Transwell实验、MTT实验和裸鼠皮下移植瘤形成实验及经鼠尾静脉远处转移实验）均证实转染WWC3通过抑制Wnt、上调Hippo通路活性发挥抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力；敲除WWC3后结果相反。在分子机制方面，我们发现WWC3可通过其自身的WW结构域 和ADDV结构域（C端PDZ 结合模体）与DVL2的PY基序和PDZ结构域直接结合，一方面，二者的结合阻碍了casein kinase 1ε（CK1ε）对DVL s的磷酸化，从而抑制了β-catenin的入核，发挥抑制Wnt通路活性的作用，而转染WWC3-△WW&ADDV则这一作用消失；另一方面， WWC3同样通过其自身的WW结构域与LATS1相互作用，使LATS1磷酸化水平上调，抑制YAP入核，上调Hippo通路活性，而转染WWC3-△WW则这一作用消失。此外，DVL2能够与LATS1竞争性结合WWC3，使LATS1的自体磷酸化水平减少，从而负性调控Hippo通路活性。因此，WWC3是引起Wnt与Hippo两个通路交互作用的重要的上游分子。这些结果为非小肺癌细胞肺癌的早期诊断和基因治疗提供了实验和理论基础。主要论文发表在Journal of Pathology上，受此课题资助共发表SCI论文7篇，其中JCR 1区2篇，IF:分别为6.253及12.46；JCR 2区2篇，累计影响因子 达36.265