N-端RASSFs中7和10对肺癌细胞不同作用的分子机制

N-terminal RASSFs (Ras-association domain family) are new members of the RASSFs, which function differently in cellular pathophysiology through distinct pathways. Though sharing similar domains, RASSF7 and RASSF10 behave oppositely in affecting NSCLC cell malignant behavior. Histologically, their expression and localization are of different clinical significances. We found out by immunoprecipitation that RASSF7 can interact with MST1, meantime RASSF10 can interact with phosphorylated LRP6. We brought up that the coiled-coil domains in RASSF7 and RASSF10 share some similarities with the SARAH domain in MST1, however, the distance between the two coiled-coils in RASSF7 is much shorter than that in RASSF10, leading to the functional diverse between these two proteins: RASSF7 overexpression can inhibit Hippo signaling pathway whereas RASSF10 upregulation can inhibit Wnt signaling pathway. This study will both up and down regulate the expression of RASSF7 and RASSF10, transfect those theoretically functional spliced plasmids as well as reconstructed plasmids, to reveal the molecular mechanisms of RASSF7-Hippo and RASSF10-Wnt interaction by means of luciferase report, immunoprecipitation and GST pull-down experiment, etc. We will also confirm our hypothesis in experiments like western blot, colony formation and MTT assay, Matrigel invasion assay, real-time PCR and nude mice tumor cell transplantation. This project will provide us a brand-new aspect of the mechanism regarding ras-associated tumorigenesis, drug resistance and new drug discovery.

N-端RASSFs蛋白的作用和机制尚在探讨之中。我们发现分子相近的RASSF7和10在肺癌中的表达、定位及临床意义均不同，双向调控表达后发现它们对肺癌细胞的增殖和侵袭能力的影响是相反的。免疫共沉淀结果发现RASSF7与MST1，而RASSF10与p-LRP6相互作用。我们提出RASSF7和10中的2个CC结构域具有经典RASSFs中SARAH结构域类似的功能，但因2个CC结构域相距不同，造成RASSF7抑制Hippo而RASSF10抑制Wnt通路活性的作用。本研究拟在双向调控RASSF7和10表达，构建和转染可能影响它们功能的各种结构域的突变质粒和互换结构质粒，结合荧光素酶报告基因和GST Pull-Down等方法，揭示RASSF7和10通过Hippo和Wnt信号通路发挥作用的分子机制，并对它们的功能和机制进行验证。研究将为了解Ras突变相关肿瘤发病、耐药机制以及新药研制提供新的思路。

虽然N-端RASSFs蛋白都含有位置相同的RA结构域，但它们的作用和机制却不同。我们发现分子结构相近的RASSF7和10在肺癌组织中的表达水平及临床意义均不同，在肺癌细胞中双向调控RASSF7和10的表达后发现它们对增殖和侵袭能力的影响也是相反的。同时，我们发现RASSF7能与MST1相互作用，进而抑制Hippo通路活性，促进肺癌细胞的增殖和侵袭能力；而RASSF10能与LRP6相互作用，通过抑制LRP6的磷酸化来抑制Wnt通路活性，从而抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力。在分子机制方面，我们发现RASSF7和RASSF10通过Coiled-coil结构域分别与MST1及LRP6结合，转染敲除两个Coiled-coil结构域的突变体（△CC）后，RASSF7和10的作用均完全消失；而转染敲除一个Coiled-coil结构域的突变体（△C1/△C2）后，RASSF7依然可以发挥作用，而RASSF10的作用被削弱，以上结果说明RASSF7与10的双Coiled-coil结构域发挥作用的机制不同，RASSF7中的双Coiled-coil结构域相距较短（25个氨基酸），因此只能起到1个Coiled-coil结构域的功能；RASSF10的双Coiled-coil结构域相距较长（超过50个氨基酸），发挥两个Coiled-coil结构域的功能，且RASSF10拥有一个超长RA结构域，能够促进双Coiled-coil结构域的抑癌功能。此外，我们发现RASSF10对Hippo通路活性没有明显影响，提示RASSF7和10是相对独立地发挥作用的。以上结果为Coiled-coil结构域在非小细胞肺癌中发挥作用的分子机制提供了实验和理论基础。主要论文发表在Molecular Carcinogenesis上，受此课题资助共发表SCI论文8篇（JCR 1区1篇；2区3篇），中文核心期刊论文1篇，累计影响因子47.157。