Klotho蛋白通过调控Kear1-Nrf2-ARE信号通路在草酸钙肾结石形成过程中的作用和机制研究

Oxidative damage is recognized as an important starting point for the development of calcium oxalate stone. But there are many ways and means of oxidative damage. Studies have shown that Klotho protein can reduce oxidative stress damage to normal cells. We found that Klotho protein can upregulate the expression of Nrf2, reduce renal tubular epithelial cells oxidative injury and stone crystal formation induced by calcium oxalate; this effect of Klotho protein may be related to the activation of the Keap1/Nrf2/ARE pathway. Based on this hypothesis, this study points that while Klotho protein reduces renal tubular epithelial cells oxidative injury and stone crystal formation induced by calcium oxalate, it can also reduce the adhesion of calcium oxalate crystals to the renal tubular epithelial cells. The role of Klotho protein may be through the Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway. This study takes rat renal tubular epithelial cells as the objects, to investigate the effects of Klotho on the oxidative damage of renal tubular epithelial cells induced by calcium oxalate crystals and the adhesion of calcium oxalate crystals and the relationship with Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway. To investigate the role and mechanism of Klotho in the formation of calcium oxalate stone, to provide evidence for the hypothesis, and to provide evidence for the prevention and cure of the calcium oxalate stone.

氧化损伤被公认为是草酸钙结石发生发展的一个重要起始环节。但氧化损伤有多种方式和途径。研究表明，Klotho蛋白能够减轻氧化应激对正常细胞的伤害。我们研究发现，Klotho蛋白可以上调Nrf2表达，减轻草酸钙诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤和结石晶体形成；提示Klotho蛋白此作用可能和Keap1/Nrf2/ARE通路的激活有关。据此本课题提出“Klotho蛋白在减轻草酸钙晶体对肾小管上皮细胞氧化损伤作用的同时，减少草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的粘附成石”这一假说。Klotho蛋白这一作用可能是通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路发挥作用的。本研究拟在大鼠肾小管上皮细胞，研究Klotho对草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤及草酸钙晶体粘附的影响，并与Keap1/Nrf2/ARE信号通路的关系。探讨Klotho在草酸钙结石形成中的作用和机制；为验证该假说提供证据；为防治草酸钙结石提供新依据。

泌尿系结石是新疆地区泌尿外科发病率第一的疾患。目前认为其发病机制为多因素所至，其中氧化应激/损伤就是其主要原因之一。本课题组在体内建立了沉默/过表达Klotho小鼠草酸钙结石模型，小鼠血清中GPx，SOD，CAT，GSH，HO-1的表达显著下降，MDA及LDH的表达显著上升,Western Blot、Real-Time PCR结果显示氧化应激关键蛋白HO-1，Nrf2，NQO-1的蛋白及mRNA表达水平显著下调，提示小鼠体内发生氧化损伤；过表达Klotho基因可逆转乙醛酸盐造成的细胞凋亡以及氧化损伤现象，而敲除Klotho基因后，会加重细胞凋亡现象及氧化损伤状态；Von Kossa染色发现：过表达Klotho基因减少草酸钙晶体对肾小管上皮的沉积与粘附，而沉默Klotho基因则反之。同时在体外分别建立了正常人肾小管上皮细胞、沉默Klotho肾小管上皮细胞、过表达Klotho肾小管上皮细胞，在草酸钙环境下孵育肾小管上皮细胞，实验结果显示在草酸钙孵育环境下：GSH，GPx，SOD，CAT，HO-1的表达显著下降，MDA及ROS的表达显著上升,提示细胞内氧化应激反应发生，过表达Klotho基因可逆转草酸钙晶体诱导的氧化应激反应，而沉默Klotho基因后，会加重氧化应激反应现象。使用AlexaFluor-488-标记草酸钙晶体，方法同前。结果表明使用草酸钙晶体孵育HKC细胞后，草酸钙晶体与HKC细胞发生黏附反应，过表达Klotho基因可减少草酸钙晶体的黏附，而敲除Klotho基因后会使草酸钙晶体的黏附增加。我们的研究结果表明：Klotho蛋白通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路抑制肾小管上皮细胞的氧化应激反应，减轻肾小管上皮细胞的损伤及凋亡，同时降低草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的粘附作用，最终抑制草酸钙肾结石的发生。本研究为防治泌尿系结石提供了新的思路和重要线索。在课题资助下，研究成果发表论文2篇，稿件录用通知论文2篇，大会录用论文2篇，其中电子壁报论文1篇。毕业硕士研究生2名，培养在读博士研究生1名，在读硕士研究生4名。完成了项目结题要求的指标。